Ornithobacterium rhinotracheale is a gram-negative bacterium responsible for the sporadic outbreaks of airsacculitis in poultry, accounting for millions of dollars in losses to the poultry industry annually. Although the organism was originally classified as non-b-hemolytic, recent North American field isolates of O. rhinotracheale obtained from pneumonic lungs and air sacs indicated hemolytic activity on blood agar plates upon extended incubation for 48 hr at room temperature in air after

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... al incubation at 37 C for 48 hr under 7.5% CO 2 . This report characterizes the b-hemolytic activity of O. rhinotracheale isolates by using in vitro kinetic hemolysis assays with sheep red blood cells, western blotting with leukotoxin-specific monoclonal antibodies, and isobaric tagging and relative and absolute quantitative (iTRAQ) analysis of O. rhinotracheale outer membrane protein digest preparations. The kinetic analyses of the hemolytic activity with red blood cells indicated that the protein is a pore former. iTRAQ analysis with membrane preparations revealed four peptides with homology to Mannheimia haemolytica leukotoxin and two peptides with homology to Actinobacillus actinoacetemcomitans leukotoxin. This is the first report that North American field isolates of O. rhinotracheale may express a hemolysin-like activity. RESUMEN. Los aislamientos de campo de Ornithobacterium rhinotracheale de América del Norte expresan una proteina tipo hemolisina. Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria gram-negativa responsable de brotes esporádicos de aerosaculitis en aves comerciales, lo que representa millones de dólares en pérdidas a la industria avícola por año. Aunque el organismo originalmente fue clasificado como no b-hemolítico, aislamientos recientes de O. rhinotracheale de América del Norte, obtenidos de pulmones con neumonía y de sacos aéreos, mostraron actividad hemolítica en placas de agar sangre después de una incubación prolongada durante 48 horas a temperatura ambiente en el aire después de una incubación inicial a 37 C durante 48 horas en un ambiente con 7.5% de CO 2 . En este reporte se caracterizó la actividad b-hemolítica de los aislamientos de O. rhinotracheale mediante ensayos de la cinética de la hemólisis in vitro con eritrocitos de oveja, inmunoelectrotransferencia con anticuerpos monoclonales específicos contra leucotoxina y por los análisis cuantitativos relativos y absolutos de las preparaciones de la digestión de la proteína externa de membrana de O. rhinotracheale (con las siglas en inglés iTRAQ). El análisis cinético de la actividad hemolítica con los eritrocitos indicaron que la proteína forma poros. El análisis iTRAQ con preparaciones de membrana reveló cuatro péptidos que mostraban homología con la leucotoxina de Mannheimia haemolytica y dos péptidos con homología con la leucotoxina de Actinobacillus actinoacetemcomitans. Este es el primer reporte que describe que los aislamientos de campo de O. rhinotracheale de América del Norte pueden expresar una actividad similar a la de una hemolisina. Abbreviations: BHI 5 brain-heart infusion; HEPES 5 4-(2-hydroxyethyl) piperizane-1-ethanesulfonic acid; iTRAQ 5 isobaric tagging and relative and absolute quantitative; lktA 5 leukotoxin A; PBS 5 phosphate-buffered saline; RBC 5 red blood cell; SDS-PAGE 5 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis