Otimização de metodologia para o estudo de genes KIR

Cristiane Conceição Chagas Rudnick, Gláucia Andréia Soares Guelsin, Amanda Vansan Marangon, Danilo Santana Alessio Franceschi, Ana Maria Sell, Jeane Eliete Laguila Visentainer
2010 Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial  
Receptores killer cell immunoglobulin-like (KIRs) são moléculas localizadas na superfície de células natural killer (NK) e em subpopulações de linfócitos T codificadas por genes do cromossomo 19q13.4. A interação entre receptores KIR e moléculas antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I determina se células NK exercerão ou não sua função citotóxica e/ou secretora de citocinas ou se esta será inibida. Este trabalho teve por finalidade otimizar a metodologia para a genotipagem KIR,
more » ... agem KIR, baseando-se nas condições descritas por Martin (2004) . A técnica utilizada foi a reação em cadeia da polimerase com primers de sequência específica (PCR-SSP) com iniciadores sintetizados pela Invitrogen ® e visualização do produto amplificado em gel de agarose a 2% com brometo de etídio. Adaptações foram realizadas e a concentração de alguns reagentes foi alterada, como a do controle interno de 100 nM para 150 nM, iniciadores específicos senso e antissenso de KIR12.5/12.3, KIR13.5/13.3, KIR14.5/14.3, KIR22.5/22.3 e KIR36.5/36.3 de 500 nM para 750 nM e da solução de MgCl 2 de 1,5 mM para 2 mM. As concentrações dos demais reagentes e temperaturas de amplificação foram mantidas. Nessas condições, o uso da Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen ® ) foi satisfatório. Os resultados das genotipagens de 70 indivíduos foram confirmados por rSSO-Luminex ® (One Lambda, Canoga Park, CA, EUA). A tipagem de genes KIR por essa técnica apresentou sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e baixo custo. resumo unitermos Células natural killer Genotipagem KIR PCR-SSP PCR-SSO abstract The killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are molecules expressed on natural killer (NK) cells surface and in T-cell subsets encoded by genes located in chromosome 19q13.4. The interaction between KIR receptors and HLA class I molecules determines if the NK cells will fulfill their cytotoxic function and/or cytokine secretion or if this function will be inhibited. The objective of this work was to optimize KIR genotyping method described by Martin (2004) . It was used PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence-specific primers) with primers synthesized by Invitrogen ® and visualization of the amplified products on 2% agarose gel electrophoresis, containing ethidium bromide. Some adaptations were made and the reagents had their concentrations increased: the internal control from 100 nM to 150 nM, forward and reverse specific primers KIR12.5/12.3, KIR13.5/13.3, KIR14.5/14.3, KIR22.5/22.3 and KIR36.5/36.3 from 500 nM to 750 nM, and MgCl 2 solution from 1.5 mM to 2 mM. Other reagent concentrations and amplification temperatures were maintained. Satisfactory results were obtained with Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen ® ). The results of seventy samples were confirmed by rSSO-Luminex ® (One Lambda,
doi:10.1590/s1676-24442010000300008 fatcat:bw5xeb2qpjhkzhn4nueq263u24