Deutsche Zusammenfassung der Doktorarbeit Multiple Faktoren, welche durch ein breites Kontinuum vom gesunden Metabolismus bis zu pathologischen Krankheitsbildern bedingt sind, können zu Veränderungen des systemischen Säure-Base-Gleichgewichts führen. Die Ausschüttung von fixen Säureund Base-Anteilen in den Urin wird durch die Nieren gesteuert, damit spielen diese eine zentrale Rolle in der Regulierung der Homöostase des Blut pH-Wertes. Das Ammonium (NH4+) / Ammoniak (NH3) Puffersystem ist

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... end für die Korrektur von schwankenden Säureladungen. In den Sammelrohren der Nieren vermitteln Typ A Schaltzellen eine Reduktion von Säure indem sie NH3 und Protonen (H+) aus dem Blut entfernen, während sie gleichzeitig Bikarbonate (HCO3-) produzieren. Die H+-Sekretion wird durch einen aktiven Transport durch die vakuolare H+-ATPase vermittelt. Protonen werden durch NH3 Moleküle im Lumen eingefangen, dabei wird NH4+ im Urin angereichert. Langezeit wurde angenommen, dass es sich dabei lediglich um einen passiven Mechanismus handelt, doch neuere Forschungsergebnisse zeigen, dass der NH3-Transporter RhCG (Rhesus Blutgruppen-assoziiertes C Glykoprotein) eine wichtige Rolle für den Transport von NH3 in den Sammelrohren der Nieren spielt. In säuregeladenen Zuständen können Mäuse, die kein Rhcg (Rhcg-/-) besitzen, nicht die nötige Menge an NH4+ ausscheiden und ihr Urin ist in der Folge stärker alkalisch als beim Wildtyp. Menschen, welche in der Fähigkeit den Urin anzusäuren, eingeschränkt sind, können an einer distalen renal-tubulären Azidose (dRTA) erkranken. Insbesondere Mutationen, welche die Isoform der H+-ATPase der Typ A Schaltzellen im Sammelrohr der Niere betreffen, können in einer erblichen Form der dRTA bei Menschen und Nagern resultieren. Nach einer chronischen Säureanreicherungsperiode, kommt es auch bei Rhcg-/-Mäusen zu einer eingeschränkten Form der dRTA. Das Ziel dieser Dissertation ist das Verständnis der Wichtigkeit von Rhcg für die Kontrolle der systemischen Säure-Base-Homöostase. Zu diesem Zweck wurden drei Projekte ins Leben gerufen. Als erstes haben wir den Effekt der einzelnen und kompletten Deletion von Rhcg auf den Säure-Base-Haushalt und den NH3-Transport durch Sammelrohrzellen untersucht. Wir haben dazu ein neues Model von Rhcg+/+, +/--/-und Mäusen, welche während 2 oder 7 Tagen eine HCl (Salzsäure) Diät erhielten, verwendet und analysiert inwiefern ein Rhcg Verlust zur metabolischen Azidose führt. Um sicherzustellen welche Rolle Rhcg auf der basolateralen Seite von Sammelrohrzellen spielt, haben wir den basolateralen Transport von NH3 in mikroperfusionierten kortikalen Sammelrohren von Rhcg+/+, +/und -/-Mäusen beobachtet. Schliesslich haben wir auch Anpassungsmechanismen in den Nieren von Rhcg+/+, +/-und -/-Mäusen an die HCl Säureladung untersucht. In der Folge haben wir in einem zweiten Projekt an Rhcg+/+, +/-und /-Mäusen die Rolle von Rhcg in einer physiologischen Situation in der eine vermehrte Ausscheidung von NH4+ in den Urin nötig wird, analysiert. Diese Erhöhung wird durch eine, für die westliche Lebensweise typische, proteinreiche Diät gefördert. Schliesslich wurde die Möglichkeit einer Interaktion zwischen Rhcg und der vakuolaren H+-ATPase in den Typ A Schaltzellen mit dem Ziel die unterliegenden molekularen Signalwege, welche für die Ansäuerung des Urins in den Sammelzellen der Nieren verantwortlich sind, zu verstehen, erforscht. Während sich die Rhcg+/+ und +/-Mäuse an die 2-tägige HCl Säurezufuhr in ihrer Nahrung anpassen konnten, entwickelten die Rhcg-/-Mäuse eine metabolische Azidose mit erniedrigter NH4+ Sekretion und sie produzierten einem stärker alkalischen Urin. Zusätzlich haben auch die Rhcg+/-Mäuse innerhalb von sieben Tagen der HCl Diät eine metabolische Azidose entwickelt und die meisten Rhcg-/-Mäuse starben vor Ende der Säurezufuhrperiode. Die Mikroperfusionsstudien der Sammelrohre der Nieren zeigten, dass die transepithelialen Durchlässigkeiten für NH3 bei Rhcg+/-Tieren zu 54 % und bei Rhcg-/-zu 80 % reduziert wurden, wenn diese mit dem Wildtyp verglichen wurden. Damit bestätigten wir, dass eine 50 %-ige Reduktion der Rhcg Aktivität ausreicht um die Antwort der Sammelrohre auf eine starke Säureanreicherung zu minimieren, in welchem Fall es schliesslich zu einer chronischen metabolischen Azidose kommt. Die apikalen und basalen Permeabilitäten der Sammelzellen der Nieren wurden bei Rhcg-Knockout Mäusen reduziert, was die Funktion von Rhcg im basolateralen Transport von NH3 bestätigt. Rhcg+/-Mäuse zeigten lediglich eine starke Reduktion der apikalen NH3 Permeabilität. Schliesslich stellten wir parallel mit einer verminderten Proteinexpression der Na+/K+/2Cl-Isoform 2 (NKCC2) des Ko-Transporters des dicken aufsteigenden Tubulus der Henle-Schleife, auch eine verminderte NH4+-Konzentration im inneren Markgewebe der Rhcg-/-Mäuse fest, was darauf hinweist, dass Rhcg einen Einfluss auf die Bildung oder Erhaltung des kortikopapillären NH3/NH4+ Gradienten hat. Proteinreiche Diäten tierischen Ursprungs, welche für den westlichen Lebensstil typisch sind, erhöhen in den Nieren die Ausscheidung von NH4+ in den Urin. Die schädlichen Effekte solcher Diäten, die insbesondere die Knochen und Nierenfunktion beeinträchtigen, wurden bereits in Tiermodellen und auch an Menschen mit normaler und reduzierter Nierenfunktion, untersucht. Die genauen Mechanismen, durch welche proteinreiche Ernährung sich auf die renale Säureausscheidung auswirkt, wurden bisher nicht im Detail etabliert. Wir haben den Einfluss einer säureanreichernden proteinreichen Ernährung wie Käsein auf Rhcg+/+, +/-und -/-Mäuse erforscht. Nach einer vorübergehenden Senkung des Blut-pHs und HCO3-in allen Genotypen, haben wir eine ähnliche Adaptation von Rhcg+/+ und +/-bei einer 9-tägigen proteinreichen Ernährung festgestellt. Die Funktionen des Na+/Glutamin Kotransporters SNAT3 und des ammoniagenen Enzyms PDG (phosphate dependent glutaminase), welches in der Produktion von NH4+ im proximalen Tubulus involviert ist, wurden erhöht. Rhcg-/-Mäuse haben dabei sogar eine stärkere Erhöhung dieser Mechanismen aufgezeigt, was möglicherweise der Kompensation dient. Eine nicht-säurehaltige proteinreiche Ernährung auf der Basis von Soja wurde als Kontrolle verwendet und hat keine Säureladung bei Rhcg+/+, +/-und -/-Mäusen induziert. Bei den Rhcg+/+ Mäusen wurde während einer säurehaltigen Diät, welche auf Käsein basierte, die Expression von NKCC2 und die Isoform 2 des H20-Kanals (AQP2) herunterreguliert, während das Volumen des Urins zunahm. Im Vergleich von Rhcg-/-Mäusen mit Rhcg+/+ Tieren zeigte sich, dass die NKCC2 Protein Expression, sowie die NH4+ Konzentration im Gewebe der inneren Medulla nach 4 Tagen der Käsein-Diät zunahmen, wobei die Expression bei beiden Gruppen nach 9 Tagen abnahm und wiederum höhere Urinvolumen beobachtet wurden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Nieren anfänglich mit einem Anpassungsprozess auf die proteinreiche Diät reagieren, wobei NH4+ direkt in den Urin ausgeschieden wird, diese Anpassung ist bei einem Fehlen von Rhcg eingeschränkt. Schliesslich haben wir bei den Rhcg-/-Mäusen auch erhöhte Zeichen von Knochenresorption in Form von Hyperkalzämie, Hyperkaliurie, und erhöhter Deoxypyridinoline (Dpd) und verminderter Knochendichte in der kortikalen Schicht des Femurs der Versuchstiere als Folge der proteinreichen Diät beobachtet. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit von Rhcg in der Regulierung des physiologischen Säure-Base-Haushalts und lassen uns vermuten, dass Rhcg auch ausserhalb der Niere Einflüsse hat. Nebst der reduzierten NH4+ Exkretion werden die Rhcg-/-Tiere auch durch einen basischeren Urin charakterisiert. In diesem Zusammenhang konnten wir bei den Rhcg-/-Tieren im Vergleich mit dem Wildtyp auch einen Defekts des NH3 Transports und eine gleichzeitige Verminderung der H+ Sekretion beobachten. Aufgrund dieser Feststellungen wollten wir eine potentielle funktionelle Interaktion zwischen Rhcg und der vakuolaren Multi-Unit-Protein H+-ATPase (H+-ATPase) untersuchen. Die H+-ATPase ist das Haupttransportsystem in den Typ A Schaltzellen der Sammelrohre. Beim Vergleich von Rhcg-/-und +/+ konnten wir keinen Unterschied in der mRNA Expression der Regulation der verschiedenen Untereinheiten der H+-ATPase feststellen, doch die Proteinmenge von B1 war erhöht, während die B2-Isoform durch eine verminderte Proteinmenge charakterisiert wurde. Schliesslich zeigte die Immunogold-Elektronenmikroskopie eine ähnliche intrazelluläre Lokalisation der A-Untereinheit der vakuolaren H+-ATPase. HEK293 Zellen, welche vermehrt RhCG expressionierten, zeichneten sich durch höhere H+-Ströme aus, wenn wie mit Zellen, welche nur vorgetäuscht transfizierten wurden, verglichen wurden und auch die Menge an ATP6V1B1 mRNA war in den Rhcg Zellen erhöht. Schliesslich haben wir auch untersucht, ob der Gebrauch eines H+-ATPase Inhibitors, Cocanamycin, zu einer entgegengesetzten Regulation führen könnte und ob Mäuse, die keine B1-Untereinheit der H+-ATPase (Atp6v1b1-/-) besitzen, eine reduzierte H+-ATPase Aktivität in den Typ A Schaltzellen des Sammelrohres aufzeigen. Der H+-ATPase Inhibitor Concanamycin reduzierte gleichzeitig die Aktivität der H+-ATPAse und Rhcg in mikroperfundierten Sammelrohren. Atp6v1b1-/-Mäuse, welche während 2 Tagen eine HCl Diät erhielten, zeigten im Vergleich mit dem Wildtyp, eine verminderte H+-ATPase Aktivtät, doch die apikale und basolaterale NH3 Permeabilität der Membranen der mikroperfundierten Schaltzellen in den Sammelrohren blieb unverändert, was zum Schluss führt, dass die Reduktion der H+-ATPase Aktivität keinen Einfluss auf die Aktivität von Rhcg hat. Diese Arbeit enthüllt damit eine funktionelle Interaktion, welche von Rhcg abhängig ist. Rhcg ist bedeutend für die volle Funktion der vakuolaren H+-ATPase des Sammelrohrs. Für eine genauere Charakterisierung dieser Interaktion sind weitere Experimente notwendig. Diese