РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ФИТОПЛАЗМЫ Candidatus Phytoplasma solani — ВОЗБУДИТЕЛЯ ПОЧЕРНЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

С.А. БЛИНОВА, ООО «Синтол»
2020 Sel skokhozyaistvennaya Biologiya  
Представители Candidatus Phytoplasma (фитоплазмы) служат возбудителями более 600 заболеваний растений. На виноградных насаждениях Европы наибольший ущерб приносят возбудитель золотистого пожелтения винограда Candidatus Phytoplasma vitis Marzorati et al., 2006 и возбудитель почернения древесины Candidatus Phytoplasma solani Qualino et al., 2013. Сходство симптомов различных фитоплазмозов винограда друг с другом, а также с вирусными и бактериальными заболеваниями делает их визуальное определение
more » ... альное определение до вида невозможным. Широкое распространение и высокая вредоносность фитоплазмозов требуют расширения исследований их эпифитотиологии. Впервые в России нами разработана тест-система для выявления фитопатогена Candidatus Phytoplasma solani и проведено ее сравнение с уже существующими системами диагностики по основным характеристикам. Нашей целью была разработка и апробация набора реагентов для выявления фитоплазмы Candidatus Phytoplasma solani, вызывающей заболевание почернения древесины винограда, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). В работе использовали образцы ДНК Candidatus Phytoplasma solani, полученные из коллекции Всероссийского центра карантина растений, и зараженный материал винограда. Фрагменты лозы, корней и листьев сортов Шардоне, Пино нуар и Бастардо магарачский с визуальными признаками заражения Candidatus Phytoplasma были отобраны в осенний период 2018 года с виноградных насаждений Южнобережного агроклиматического района полуострова Крым. Пробы состояли из листьев, фрагментов лозы и корней винограда. ДНК фитоплазмы выделяли согласно методике, рекомендованной EPPO, с модификациями, а также с помощью набора реагентов Цитосорб (ООО «Синтол», Россия). Классическую ПЦР и ПЦР-РВ проводили в реакционном буфере, в состав которого входили 3 мM MgCl 2 , 0,25 мM dNTP, 2,5 ед. SynTaq ДНКполимеразы с антителами, ингибирующими активность фермента (ООО «Синтол», Россия). Для секвенирования ДНК Candidatus Phytoplasma solani сконструировали пару праймеров SolaSeq_F 5-AACTTAACCTTTTAACTAGGGC-3 и SolaSeq_R 5-CATCAAGGCATTTGCC-3. Для определения аналитической чувствительности набора реагентов была создана векторная конструкция на основе плазмиды Pal2T («Евроген», Россия) со вставкой целевой нуклеотидной последовательности Candidatus Phytoplasma solani размером 119 п.н. Специфичность набора реагентов проверяли на 37 образцах близкородственных и сопутствующих объектов. Разработанные праймеры на участок гена SecY позволяли идентифицировать ДНК фитоплазмы Candidatus Phytoplasma solani всех штаммов, последовательности которых находились в базе данных GenBank NCBI Nucleotide на 16.01.2019. Нуклеотидная последовательность гена SecY, в отличие от рекомендованных для диагностики, имела более высокую специфичность и консервативность. Набор реагентов был испытан на разных приборах для ПЦР-РВ. Его аналитическая чувствительность составила не менее 15 копий на реакцию, аналитическая специфичность -100 %. Ложноположительных результатов при анализе проб в присутствии ДНК других видов фитоплазм, а также сопутствующих микроорганизмов не выявлено. Ложноотрицательных результатов при анализе проб с наличием ДНК целевого организма также не получили. Разработанный набор был апробирован при анализе 194 образцов, предположительно зараженных Candidatus Phytoplasma solani, из шести различных мест произрастания. Во всех случаях специфичность выявления фитоплазмы, вызывающей почернение древесины, подтвердило секвенирование ДНК образцов, положительных по гену SecY. Таким образом, разработанный набор реагентов позволяет быстро, точно и с высокой чувствительностью проводить диагностику инфицированности растений фитоплазмой Candidatus Phytoplasma solani на всех этапах вегетации (в том числе тестировать посадочный материал) и может использоваться для полномасштабных скрининговых исследований. Ключевые слова: фитоплазма, Candidatus Phytoplasma solani, виноград, ПЦР в реальном времени, диагностика, ПЦР-РВ тест-система, специфичность, чувствительность, воспроизводимость, повторяемость. * Исследования выполнены в рамках государственного задания ВННИИВиВ «Магарач» РАН ¹ 0833-2015-0019.
doi:10.15389/agrobiology.2020.1.194rus fatcat:7hrsqgoiajbvrojlzqhhsibyvy