Показано можливість досягнення високої ефективності трансформації К. pneumoniae методом електропорації. Виявлено регуляторну здатність білків LlO Е. соїі з нативною та зміненою первинною структурою стосовно генів оперону rplJL К. pneumoniae. Продовжуючи наші дослідження з вивчення можливості регуляції експресії генів rplJL оперону ентеробактерій гетерологічними білками LlO [1, 2], ми провели аналіз впливу суперпродукції білків LlO Е. соїі (нативного та із зміненою первинною структурою) на

more »

... и К. pneumoniae. Як реципієнт використовували штам' K-pneumoniae NCTC 5054 (National collection of type cultures, Central Public Health Laboratory, Лондон, Великобританія). Плазмідну ДНК до клітин-реципієнтів вводили методом електропорації, який був описаний нами раніш для Salmonella typhimurium [2]. Слід особливо відзначити, що нас цікавив вибір оптимального засобу введення чужорідної ДНК щодо ряду ентеробактерій. До теперішнього часу ми порівняли ефективність введення плазмідної ДНК до Е. соїі, S. typhimurium і К. pneumoniae за посередництвом трансформації клітин,які обробляли CaCl 2 за стандартною методикою [3], її модифікаціями [4] та електропораціею [2, 5]. Експерименти виявили, що введення плазмід, котрі нас цікавили, до клітин Д. соїі є найбільш ефективним за допомогою трансформації CaCl 2клітин за стандартною методикою та її модифікаціями [3]. Щодо S. typhimurium і К. pneumoniae, навпаки, найбільшої ефективності можна досягти електропораціею. Виявилося, що клітини Е. соїі набагато чутливіші до концентрації солі у розчині ДНК, який використовують для електропорації, і підвищення температури у процесі впливу на клітини електричним імпульсом. У попередніх дослідах було виявлено пряму залежність ефективності електропорації клітин К. pneumoniae від ємкості конденсаторної батареї (тривалості імпульсу) та напруги електричного поля аж до величин 14,5 мФ і 27 кВ/см відповідно. Ефективність трансформації при цьому складала приблизно IO 7 колоній на 1 мкг ДНК плазміди 19ХтаСАТ (Сш г -похідної від pl)C19). Ці ж умови було використано і в подальшому для введення плазмід, які забезпечують експресію білків L10. Нас цікавив ефект підвищеного синтезу у клітинах К. pneumoniae нативного білку LlO Е. соїі, котрий у випадку збереження регуляторної здатності у гетерологічному хазяїні призводив би до характерного ефекту -негативному впливу підвищеної продукції LlO на життєздатність клітин-хазяїв. Цей негативний ефект виявляється через уповільнення швидкості росту клітин та зниження копійності плазмід, які кодують регуляторноздатні білки [2]. У даній роботі проведено порівняння впливу високих рівнів продукції у К. pneumoniae білків LlO з різною первинною структурою: