Tandem purification of Mre11/Rad50-dimers using the baculovirus expression system

Tanja Rast
2012
DNS-Doppelstrangbrüche (DSB) aktivieren den Mre11/Rad50/Nbs1-Komplex (MRN). DSBs gehören zu den toxischsten Arten von DNS-Schäden, sie Aktivieren die DNS-Schadensantwort, welche die Zellzykluskontrolle, DNS-Reparaturmechanismen und Transkriptionsprogramme startet oder Apoptose und Alterung auslöst, wenn der Schaden zu schwer ist. Non-homologous end joining und die Homologe Rekombination sind die zwei Hauptwege der DSB-Reparatur. MRN ist als Sensor der DSBs involviert, es bindet an die DSBs und
more » ... et an die DSBs und wird in die angrenzenden Chromatin Kompartimente rekrutiert. Unser Labor hat MRN und MR-Subkomplexe von Baculovirus infizierten Insektenzellen aufgereingt und diese von unserem Partner mit Einzelpartikelelektronenmikroskopie (EM) analysieren lassen. Die Analyse zeigte, dass MR-Heterodimere als Monomere, Multimere und Proteinaggregate vorhanden waren und es nicht möglich war diese für die Analyse zu separieren. Deshalb war das Ziel dieses Projektes MR-Heterodimere für eine EM-Analyse zu isolieren und aufzureinigen. Dafür wurden unterschiedlich markierte Mre11 und Rad50 in doppelinfizierten Insektenzellen exprimiert und Tandem aufgereinigt. Während das ursprüngliche Ziel wegen technischen Schwierigkeiten und Zeitmangel nicht erreicht wurde, konnte gezeigt werden, dass Polyhistidin-markiertes Rad50 gemeinsam mit nichtmarkiertem Mre11 aufgereinigt werden kann, was darauf hinweist, dass diese zwei Humanproteine einen Komplex formen, wenn sie koexprimiert werden in Insektenzellen. The Mre11/Rad50/Nbs1-complex (MRN) is activated in response to DNA double-strand breaks (DSB). DSBs belong to the most toxic forms of DNA-damage, they lead to the activation of the DNA damage response (DDR), which ultimately results in the activation of cell cycle checkpoints, coordination of DNA repair mechanisms, induction of transcriptional programs or apoptosis and senescence if the damage is too severe. The two main DNA repair pathways to overcome DSBs are non-homologues end joining (NHEJ) and homologues recombination (HR). MRN is involved as sensor of DSBs, it binds to DSBs and is recruited to DSB-flanking chromatin compartments. Our lab has purified MRN and MR subcomplexes from Baculovirus-infected insect cells and our collaborator analysed these by single-particle electron microscopy (EM). The analysis revealed that the MR heterodimers were present as monomers, multimers and protein aggregates and it was not possible to separate and properly analyse them. Thus, the goal of this project was to isolate and purify MR heterodimers for subsequent EM analysis. For this, differentially-tagged Mre11 and Rad50 were co-expressed in insect cells and tandem purified. While the original goal was not achieved due to technical difficulties and time constraints, the result of this thesis revealed that polyhistidine-tagged Rad50 co-purifies with untagged Mre11, which indicates that these two human proteins form a complex when co-expressed in insect cells. Faculty. analyse them. Thus, the goal of this project was to isolate and purify MR heterodimers for subsequent EM analysis. For this, differentially-tagged Mre11 and Rad50 were co-expressed in insect cells and tandem purified. While the original goal was not achieved due to technical difficulties and time constraints, the result of this thesis revealed that polyhistidine-tagged Rad50 co-purifies with untagged Mre11, which indicates that these two human proteins form a complex when co-expressed in insect cells.
doi:10.5167/uzh-164151 fatcat:42inlgaq3baobf2naqzu5m2u5y