780. Inhibition of Respiratory Syncytial Virus Gene Expression and Replication by 27mer Dicer Substrate siRNAs

Anthony J. Fischer, Christine L. Wohlford-Lenane, Scott D. Rose, Steven M. Varga, Mark A. Behlke, Paul B. McCray
2006 Molecular Therapy  
RNA interference (RNAi) pathway is a gene silencing process during which small double-stranded RNA (dsRNA) molecules trigger the degradation of homologous RNA targets. Small interfering RNAs (siRNAs) are the mediators of the RNAi that can be induced in vitro and in vivo by direct application of chemically synthesized siRNAs. Recently, promoter-targeted small non-coding RNAs have been described to be capable of regulating gene expression at the transcriptional level. In the present study we
more » ... esent study we tested the hypothesis that Dicer-substrate siRNAs (D-siRNAs), which trigger gene silencing through intrinsic RNAi pathway and are therefore more potent in gene knockdown than traditionally used 21-23mer siRNAs, may also display regulatory eff ects at the transcriptional level. Synthetic 27mer D-siRNAs targeting the promoter/early coding region of the CDKN2A gene were designed and transfected into HeLa cells, and 48 h post-transfection the CDKN2A expression was analyzed in quantitative real-time PCR using the housekeeping G6PDH gene as reference. In comparison to the mutant version, the CDKN2A gene was eff ectively knockeddown by the D-siRNA, but no evidence of transcriptional regulation was found. We conclude that the D-siRNA-induced suppression is likely to occur aft er transcription. Dicer-substrat siRNA'ların gen ifadesini yazılım aşamasında düzenleme kabiliyetlerinin test edilmesi Özet: RNA interferans (RNAi) yolağı, özdeş hedef mRNA moleküllerinin yıkımına yol açarak, gen ifadesinin yazılım sonrası aşamada düzenlenmesini içerir. Küçük müdahaleci RNA'lar (siRNA'lar), RNAi yolağının aracı molekülleridir ve RNAi, sentetik siRNA'lar kullanılarak in vitro ve in vivo olarak oluşturulabilir. Güncel çalışmalar, promotör bölgelerine hedefl endirilmiş küçük kodlamayan RNA'ların gen ifadesini yazılım aşamasında da düzenleyebilme özelliğinde olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, gen susturulmasını intrinsik RNAi yolağı ile gerçekleştiren ve bu nedenle geleneksel olarak kullanılan 21-23mer siRNA'lardan daha etkin olduğu gösterilen Dicer-substrate siRNA'ların (D-siRNA'lar) yazılım aşamasında düzenleyici işlevlere sahip olabileceiği hipotezini test ettik. CDKN2A geninin promotör/erken kodlayan bölgesine özgül 27-mer D-siRNA ve bunun merkezi bölgesinde 4 adet baz değişimi içeren mutant versiyonu tasarladı. siRNA'lar HeLa hücrelerine transfekte edildi ve 48 saat sonra CDKN2A ifade düzeyi gerçek-zamanklı PCR' da yaşamsal gen G6PDH referans olarak kullanılarak değerlendirildi. Mutant versiyon ile karşılaştırıldığında, D-siRNA etkin bir şekilde CDKN2A geninin susturulmasına yol açtı, ancak baskılanmanın yazılım aşamasında gerçekleştiğine dair bir bulgu elde edilmedi. Bu bulgulardan yola çıkarak, D-siRNA'nın yol açtığı gen susturulmasının yazılım sonrası gerçekleştiğini kabul etmekteyiz. Anahtar sözcükler: RNA interferans, Dicer-substrat siRNA'lar, gen susturulması, CDKN2A
doi:10.1016/j.ymthe.2006.08.867 fatcat:dqluod4jpba73c34i4my23m47i