Photoregulated oligonucleotide detachment as a way to improve the efficiency of polymerase chain reaction with reverse transcription for analysis at the single cell level
Фоторегулируемое отщепление олигонуклеотида как способ повышения эффективности полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией при анализе единичных клеток

I.B. Kozlov, National Research Center – Institute of Immunology of the Federal Medical and Biological Agency, Moscow, M.Yu. Lebedin, G.O. Gudima, I.V. Sergeev, I.A. Kofiadi, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Moscow, National Research Center – Institute of Immunology of the Federal Medical and Biological Agency, Moscow, National Research Center – Institute of Immunology of the Federal Medical and Biological Agency, Moscow, National Research Center – Institute of Immunology of the Federal Medical and Biological Agency, Moscow
2021 Immunologiya  
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация 2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация Резюме Введение. Благодаря
more » ... ию технологий секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) появилась принципиально новая возможность анализа экспрессии групп генов, определяющих конкретную функцию и позволяющих отслеживать эволюцию клетки как в нормальных условиях, так и при развитии патологии. Технологии, при помощи которых изучают единичные клетки, позволяют отслеживать мутационные изменения в генах специфических клеточных популяций и находить связи с проявлением конкретных клинических признаков. Наибольший интерес в этом смысле представляют популяции лимфоцитов и их рецепторы, участвующие в распознавании антигенов. Однако существующие технологии scRNA-seq недостаточно эффективны для изучения рецепторных репертуаров лимфоцитов. Одним из ограничений метода является недостаточная эффективность синтеза комплементарной ДНК (кДНК) на твердой фазе. Цель исследования -разработать технологию синтеза и фоторегулируемого высвобождения олигонуклеотидов с поверхности твердофазного носителя для повышения эффективности синтеза кДНК на матричной РНК (мРНК) на примере гена α-цепи Т-клеточного рецептора отдельных клеток. Материал и методы. Создана технология синтеза олигонуклеотидов на твердофазном носителе с возможностью их контролируемого высвобождения в раствор. Данный процесс обеспечивается встраиванием фоточувствительных молекул в структуру олигонуклеотида на стадии синтеза. Деструкция линкера происходит в условиях мягкого УФ-излучения, не повреждающего структуру биополимера, и приводит к существенному повышению эффективности обратной транскрипции (ОТ). Результаты. В работе была использована олигонуклеотидная последовательность длиной 39 нуклеотидов, содержащая короткий спейсер, фоторазрушаемый линкер (PCлинкер от англ. photocleavable), уникальный молекулярный баркод, участок для гибридизации универсального праймера и фрагмент, специфичный к последовательности α-цепи Т-клеточного рецептора. Синтез проводили с помощью «инвертированных» амидитов с целью корректной ориентации олигонуклеотида на носителе, обеспечивающей синтез кДНК. Установлено, что встраивание РС-линкера в структуру олигонуклеотида позволяет высвободить с поверхности носителя все доступные для УФ-индуцированного отщепления последовательности в течение 5 минут. Сравнение наработки целевого продукта в ОТреакциях с фотоактивацией и без продемонстрировало существенные отличия в количестве наработанного продукта. Разница по количеству кДНК в 2 параллельных реакциях составила приблизительно 7 циклов ПЦР, что позволяет говорить о более чем 100-кратном превышении исходного количества специфической мишени в реакции с PC-линкером. Заключение. В результате исследования разработана технология фоторегулируемого отщепления олигонуклеотидов с твердого носителя. Мы продемонстрировали, что PCлинкер не оказывает существенного влияния на эффективность синтеза полинуклеотидной цепи и может быть использован при твердофазном синтезе длинных дезоксирибонуклеотидных последовательностей. С помощью эмульсионной ПЦР установлено, что применение PC-линкера существенно повышает эффективность синтеза кДНК на мРНК единичных клеток. Для корреспонденции Кофиади Илья Андреевичдоктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России,
doi:10.33029/0206-4952-2021-42-6-662-669 fatcat:s65xjhge6nag5mfdxfxojuyyzq