Úvod Lactobacillus helveticus je používán jako zákysová kultura při výrobě sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou (Grana Padano, Parmigiano Reggiano, Emmental) a s nízkodohřívanou sýřeninou (Cheddar, Edam). Tento druh disponuje vysokým zastoupením intracelulárních proteolytických enzymů, které po uvolnění z buňky do těsta sýru pomocí autolýzy významně přispívají ke snížení hořkosti hydrolýzou hydrofobních peptidů, k zlepšování senzorických vlastností zvýšením produkce volných ami-nokyselin a k

more »

... ování zracího procesu 1-3. Míra autolý-zy jednotlivých kmenů L. helveticus při výrobě sýrů (in situ) je jedním z důležitých kritérií při výběru aplikovatel-ných kmenů 4,5. Ke stanovení autolýzy in situ je možné použít buď samotnou výrobu sýru, která je osvědčeným, ale dlouhým a ekonomicky náročným procesem, nebo řadu in vitro metod, které vynikají nízkými náklady a rychlostí 6. Za nejjednodušší screeningovou metodu in vitro je považová-no pozorování bakteriální suspenze v nutričně chudém prostředí, jako je například pufr, kde buňky mají spontánní tendenci autolyzovat 7. V pufrech je míra autolýzy obvykle detekována úbytkem buněk pomocí spektrofotometrického stanovení nebo stanovením počtu životaschopných buněk plotnovou metodou, stanovením přítomnosti a aktivity intracelulárních komponent (DNA, RNA, enzymy), mikro-skopickým pozorováním nebo pozorováním aktivity lytic-kých enzymů (difuzní agarová zkouška, zymogram) 6. Gramovo barvení sloužilo historicky k rozlišení bak-terií na dvě skupiny, které se vzájemně liší stavbou buněč-né stěny. Bylo zjištěno, že s použitím tohoto barvení lze u L. helveticus pozorovat změnu zbarvení buněk při stano-vení autolýzy v pufru 8. Původně grampozitivní buňky L. helveticus (modro-fialové zbarvení) mění barvu a jeví se jako gramnegativní (růžovo-červené). Tato Gram-labilita je diskutována u některých mikroorganismů (např. Ba-cillus spp.) 9 , ale nikdy nebyla spojována s autolýzou u L. helveticus. Průtoková cytometrie je známa jako velice přesná analytická metoda poskytující informace o stavu a změ-nách bakteriální populace 10. K rozlišení grampozitivních a gramnegativních bakterií lze využít metod průtokové cytometrie s vhodným fluorescenčním barvením. Specific-ká barviva pro grampozitivní bakterie jsou například lipo-filní barvivo rhodamine 123, barvivo HI (hexidium iodid) nebo barvivo WGA (fluorescein-conjugated lecithin wheat germ agglutinin), které se váže na N-acetylglukosamin v peptidoglykanu buněčné stěny. Těmto barvivům lipopo-lysacharidy v buněčné stěně brání proniknutí do gramne-gativních buněk a obarvit je 11. Pro odlišení gramnegativ-ních bakterií lze použít doplňkové barvivo, které barví všechny buňky ve vzorku. Jako vhodné se ukázalo barvivo HI, pokud je s buňkami inkubováno v roztoku EDTA při 50 °C po dobu 15 min (cit. 11). Cílem této práce bylo zjistit, zda je možné průtokovou cytometrií odlišit v pufru autolyzované buňky L. hel-veticus, jevící se při Gramově barvení jako gramnegativní, od buněk grampozitivních. Experimentální část Kmeny a růstové podmínky V této práci byly použity tři kmeny L. helveticus (CNRZ 32J-zákysová kultura Comté, Francie, CNRZ 414-kumys, Rusko a ICT BROI-syrové kravské mléko, Česká republika) získané z různých zdrojů, a to jak vzhle-dem k biotopu, tak vzhledem k zeměpisnému původu. Všechny kmeny byly kultivovány v MRS bujónu (Oxoid, Anglie) aerobně při teplotě 42 °C po dobu 16 h. Příprava buněk a autolýza v pufru Kmeny byly očkovány inokulem 1 obj.% do 50 ml MRS bujónu a kultivovány po dobu 12 h. Poté byly odstře-děny za podmínek: 9000 ot min-1 při teplotě 4 °C po dobu 15 min. Po odstředění byl supernatant dekantován a buňky byly 2krát promyty ve 40 ml -glycerofosfátového pufru (Sigma-Aldrich) 12. Promyté buňky byly převedeny do fosfátového pufru (0,1 mol l-1 , pH 7,0) a jím zředěny na výslednou absorbanci 0,8-0,9 měřenou při vlnové délce 650 nm. Takto připravená buněčná suspenze ve fosfáto-vém pufru byla kultivována při teplotě 42 °C po dobu 6 h.