RESUMO KAWAI, L. A. Melhoramento da eficiência de produção de polihidroxialcanoatos por Pseudomonas sp. através da análise molecular e modificação genética. 2013. 94 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) -Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. A análise de fluxos metabólicos (AFM) do processo de produção de PHA MCL por Pseudomonas sp. LFM046 a partir de carboidratos revelou que essas fontes de carbono são metabolizadas principalmente pela via das

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... ses (VP) que determina uma baixa eficiência de sua conversão em PHA (60-70% do valor máximo teórico). De acordo com modos elementares obtidos, eficiências significativamente maiores poderiam ser obtidas se uma parcela maior da glicose fosse metabolizada pela via Entner-Doudoroff (ED). Deste modo, o objetivo principal deste trabalho foi a realização da análise de fluxos metabólicos utilizando glicose marcada (C 13 ) e o melhoramento genético de Pseudomonas sp. LFM046 utilizando estratégia de engenharia metabólica. Para cumprir estes objetivos, foram realizadas as seguintes etapas: (i) realização de experimentos para definição da melhor concentração de nitrogênio e fósforo a utilizar no meio de cultura favorecendo a produção de PHA; (ii) após a definição da composição do meio de cultura, foram realizados experimentos com glicose marcada com carbono 13, para confirmar os mecanismos de metabolização de carboidratos em Pseudomonas sp. LFM046; (iii) análise da presença dos genes edd e eda, específicos da via de Entner-Doudoroff em bactérias do gênero Pseudomonas através de buscas realizadas em bibliotecas genômicas; (iv) desenho de iniciadores genéricos (degenerados) para os genes edd e eda, à partir dos genes sequenciados (v) detecção de genes específicos da via de Entner-Doudoroff em Pseudomonas sp. LFM046 utilizando os iniciadores degenerados; (vi) Avaliação da expressão de genes específicos da via Entner-Doudoroff em Pseudomonas sp. LFM046 utilizando RT-PCR (reverse transcriptase) e (v) superexpressão de genes específicos da via Entner-Doudoroff em Pseudomonas sp. LFM046, através de clonagem de plasmídeos contendo inserto destes genes. Os experimentos com glicose marcada confirmaram um maior fluxo de carboidratos pela VP em relação a ED. Os genes edd e eda foram detectados com sucesso no genoma de Pseudomonas sp. LFM046. A expressão destes genes foi detectada por RT-PCR, mas ainda necessitam ser confirmados pelo sequenciamento dos amplicons. A superexpressão de genes específicos de ED em Pseudomonas sp. LFM046 demonstrou apenas pequenos aumentos na eficiência de conversão de carboidratos em PHA pelas linhagens recombinantes. Palavras -chave: Polihidroxialcanoatos. Pseudomonas. Glicose marcada. Análise de fluxos metabólicos. Via de Entner-Doudoroff. Recombinantes. ABSTRACT KAWAI, L. A. Improvement of the efficiency of polyhydroxyalkanoates production by Pseudomonas sp. through molecular analysis and genetic modification. 2013. 94 p. Masters thesis (Microbiology) -Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. The metabolic flux analysis (AFM) of PHA MCL production by Pseudomonas sp. LFM046 from carbohydrates revealed that these carbon sources are metabolized primarily by the pentose phosphate pathway (VP) which determines a low efficiency of conversion into PHA (60-70% of theoretical maximum). According to elementary mode analysis, significantly higher efficiencies could be obtained if a larger portion of the glucose was metabolized by the Entner-Doudoroff pathway (ED). Thus, the main objective of this study was to perform the metabolic fluxes analysis using labeled glucose ( 13 C) and the genetic improvement of Pseudomonas sp. LFM046 using metabolic engineering strategy. To meet these objectives, the following steps were taken: (i) perform experiments to define the best concentration of nitrogen and phosphorus to use in the culture medium favoring the production of PHA; (ii) after the definition of the composition of the culture medium, experiments using glucose labeled with carbon 13 were performed, in order to confirm the mechanisms of carbohydrates metabolism in Pseudomonas sp. LFM046; (iii) evaluation of the presence of genes eda and edd specific from the Entner-Doudoroff pathway in Pseudomonas through searches performed in genomic libraries; (iv) designing generic primers (degenerated) for edd gene and eda , from sequenced genes; (v) detection of specific genes from Entner-Doudoroff pathway in Pseudomonas sp. LFM046 using the degenerate primers; (vi) Evaluation of the expression of specific genes from Entner-Doudoroff pathway in Pseudomonas sp. LFM046 using RT-PCR (reverse transcriptase) and (v) overexpression of the specific genes from Entner-Doudoroff pathway in Pseudomonas sp. LFM046 in plasmids containing these genes. The experiments with labeled glucose confirmed an increased flow of carbohydrates by VP compared to ED. The genes edd and eda were successfully detected in the genome of Pseudomonas sp. LFM046. The expression of these genes was detected by RT-PCR but their identities should be confirmed by sequencing the amplicons. The overexpression of specific genes from ED in Pseudomonas sp. LFM046 showed only small increases in the efficiency of conversion of carbohydrates into PHA by recombinant strains.