Caracterização funcional e estudo dos mecanismos de resposta ao dano celular causado por uma L-aminoácido oxidase de Calloselasma rhodostoma em linhagens celulares humanas [thesis]

Tássia Rafaella Costa
Dedico essa Tese aos meus avós: Arthur e Zezé, Pessoas maravilhosas, que sempre estiveram ao meu lado, e que muitas vezes abdicaram de seus próprios anseios a favor dos meus. Guardarei para sempre seus ensinamentos, seus gestos solidários, seus exemplos de honestidade, e principalmente o amor e o carinho com que sempre me protegeram e me ensinaram os limites da vida! A vocês minha eterna gratidão!! Simplesmente Amo vocês!! À Deus que me carregou quando faltaram forças... Aos meus queridos pais:
more » ... meus queridos pais: Emília e Omar, por terem sempre estado ao meu lado apoiando-me em todas as minhas decisões e dando-me todo o carinho e amor. Por terem investido e acreditado sempre na educação e me incentivado a trilhar meu próprio caminho e não desistir dos meus sonhos. Por acreditarem em mim e por compartilhar das minhas angústias e conquistas. Alcançamos juntos mais essa vitória. Amo os imensamente. Ao meu irmão Thiago e a minha "cunha" Lívia, por cada momento vivido, pelo apoio e palavras de incentivo. Sem vocês essa vitória não teria o mesmo sentido. Amo vocês!! À minha família e aos meus amigos, que de alguma forma me ajudaram a chegar até este momento. Pelo apoio e força para seguir em frente. Vocês são minha fonte de momentos de alegria e descanso do trabalho. À minha orientadora, Dra. Suely Vilela, por ter me acolhido em seu laboratório, pela orientação, pelos ensinamentos e pela paciência nesses quase quatro anos de convívio acadêmico, e, sobretudo, pela oportunidade da conquista de mais este Título. À minha co-orientadora, Profa. Lusânia Antunes, pelo carinho e prontidão com que sempre me recebeu em sua sala me auxiliando na interpretação de resultados. E principalmente por ter disponibilizado equipamentos imprescindíveis para a execução dos experimentos. Aos colegas e amigos do Sante e Luiz, e todos os outros com quem tive o prazer de conviver durante esse tempo. Pela amizade, companheirismo, ensinamentos, diversão e apoio sempre. Com certeza vocês tornaram a minha caminhada menos árdua. À Raquel, por ter me acolhido e me ajudado em uma etapa tão importante, como a elaboração do projeto. Ao Cássio "Ksim", o meu primeiro guia nesse mundo fantástico da biologia celular e molecular. Obrigada pelos ensinamentos, pelas conversas, desabafos, carinho e respeito. Valeu demais seu "Grazy". Ao Prof. Dr. Sandro Ghisla da Universidade de Konstanz na Alemanha, por ter fornecido a CR-LAAO, proteína alvo dos estudos desenvolvidos nesse projeto de doutorado. À todos os professores que colaboraram de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho, cedendo espaço em seus laboratórios, fornecendo idéias e sugestões ou dispondo de tempo precioso para auxiliar na interpretação dos resultados ou mesmo nos experimentos. Ao Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP), em especial ao funcionário Rodrigo Sorrechia, que sempre me recebeu com muito carinho e que por mais de dois anos me auxiliou na execução das atividades bactericida e fungicida. À Profa Dilu, aos alunos e funcionários do Laboratório de Nutrigenômica da FCFRP. Em especial ao aluno Alexandre Ferro Aissa que me ajudou com muita dedicação e boa vontade nos ensaios e análises de RT-qPCR . Ao laboratório de Hematologia da FCFRP, em especial a funcionária Luciana Ambrosio e a aluna Sandra Burin, que me auxiliaram na execução e análises de Western-blot. À Profa. Lúcia Faciolli, alunos e funcionários do laboratório Imunologia e Inflamação das Parasitoses da FCFRP. Em especial a aluna Karina Zoccal que me ajudou nos ensaios de inflamação, obrigada pelos ensinamentos, pela paciência e pelo auxílio na interpretação dos resultados. A funcionária Fabiana Rosseto de Morais, pelo auxílio nas análises de citometria de fluxo, pela amizade e pelo carinho com que sempre me recebeu em sua sala. Ao laboratório de Parasitologia da FCFRP, em especial a funcionária Cristiana Gonçales, que me auxiliou na execução dos ensaios leishmanicida e tripanomicida. Ao laboratório Especial de bacteriologia e epidemiologia molecular da FCFRP, por ter fornecido as cepas bacterianas utilizadas nos ensaios bactericidas. Em especial à funcionária Joseane Cristina Ferreira, por ter me auxiliado na preparação das amostras para as análises microscópicas. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP), à Universidade de São Paulo (USP) e a todos os seus funcionários, por tudo o que me proporcionaram para a conclusão do meu doutorado. À FAPESP (Processo 2011/02645-3) pelo auxilio financeiro, favorecendo o bom desempenho do projeto. As fundações CAPES e CNPq, ao NAP-TOXAN-USP e ao USP/FUSP/FINEP (no. 01.09.0447.00 -CT-INFRA 2008 -Sub-projeto 228524) pelo auxilio financeiro. "Quero, um dia dizer às pessoas que nada foi em vão.... Que o amor existe e que vale a pena se doar às amizades e às causas, que a vida é bela sim e que eu sempre dei o melhor de mim... e que valeu a pena." Mário Quintana i RESUMO COSTA, T. R. Caracterização funcional e estudo dos mecanismos de resposta ao dano celular causado por uma L-aminoácido oxidase de Calloselasma rhodostoma em linhagens celulares humanas. 2014. 162 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) isoladas de peçonhas de serpentes são alvos de um grande número de pesquisas devido às suas inúmeras ações biológicas e farmacológicas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar funcionalmente a Laminoácido oxidase da peçonha de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) por meio das atividades: bactericida, fungicida, leishmanicida, tripanomicida, citotóxica, inflamatória e análise da expressão de genes e proteínas apoptóticas. A CR-LAAO mostrou-se altamente citotóxica sobre as células tumorais HepG2 e HL-60, promovendo cerca de 80% de morte celular na maior concentração testada (100 µg/mL) e apresentou baixa toxicidade sobre células PBMC. Foi possível observar que a proteína induziu apoptose (AV+) em PBMC. Em HepG2, as menores concentrações (0,1-2,5 µg/mL) causaram apoptose (AV+), e as maiores (5-100 µg/mL) causaram apoptose/necrose (PI+/AV+). Em HL-60, as concentrações testadas (0,1-100 µg/mL) induziram apoptose/necrose (PI+/AV+). A expressão do gene FAS e ativação das caspases 8 e 3 determinou a ativação da via extrínseca da apoptose na linhagem HL-60. A CR-LAAO promoveu algumas alterações na modulação do ciclo celular, sendo que nas linhagens tumorais os atrasos se concentraram nas fases G0/G1 e S do ciclo celular. Ademais, a CR-LAAO mostrouse bactericida contra as cepas S. aureus e E. coli, com maior especificidade para a cepa gram-positiva (S. aureus). Em análises de microscopia de transmissão, foi possível observar um desmantelamento da parede celular bacteriana. Após 6h de pré-incubação com C. albicans, a CR-LAAO foi capaz de inibir 80% do crescimento da levedura. A CR-LAAO mostrou-se também um bom agente leishmanicida contra as espécies L. infantum chagasi (IC50=16,66 µg/mL) e L. braziliensis (IC50=24,47 µg/mL) e inibiu o crescimento da forma promastigota do Trypanosoma cruzi (IC50=196,8 µg/mL). Testes in vivo revelaram que a CR-LAAO promoveu inflamação local aguda, recrutando células inflamatórias como neutrófilos e induzindo a formação de citocinas (IL-6 e IL-1β) e mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2). Os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta potencial biotecnológico evidente, com efeitos antiparasitários, fungicida, bactericida, bem como atividade antitumoral in vitro. Dessa forma, os resultados obtidos para a CR-LAAO fornecem subsídios importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de ação direcionada, como quimioterápicos e antimicrobianos mais eficazes. ABSTRACT COSTA, T. R. Functional characterization and study of the mechanisms of response to the cellular damage caused by an L-amino acid oxidase from Calloselasma rhodostoma in human cell lines. 2014. 162 f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. L-amino acid oxidases (LAAOs) isolated from snake venoms are targets of a large number of researches due to their numerous biological and pharmacological actions. The objective of this study was to functionally characterize the L-amino acid oxidase from the venom of Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) through the activities: bactericidal, fungicidal, leishmanicidal, trypanocidal, cytotoxic, inflammatory and analysis of gene expression and apoptotic proteins. CR-LAAO showed high cytotoxicity in HepG2 and HL-60 tumor cells, inducing about 80% cell death at the highest concentration tested (100 µg/mL) and showing low toxicity in PBMC cells. It was observed that the protein induced apoptosis (AV+) in PBMC. In HepG2, lower concentrations (0.1-2.5 µg/mL) caused apoptosis (AV+), while major concentrations (5-100 µg/mL) caused apoptosis/necrosis (PI+/AV+). In HL-60, the concentrations tested (0.1-100 µg/mL) induced apoptosis/necrosis (PI+/AV+). The FAS gene expression and activation of caspases 8 and 3 determined the activation of the extrinsic pathway of apoptosis in HL-60 cells. CR-LAAO promoted some changes in the modulation of the cell cycle, and delays in tumor cell lines were concentrated in G0/G1 and S cell cycle phases. In addition, CR-LAAO proved to be bactericidal against S. aureus and E. coli strains, with higher specificity for Gram-positive strains (S. aureus). In analyses of transmission electron microscopy, it was possible to observe a dismantling of the bacterial cell wall. After 6 hours of preincubation with C. albicans, CR-LAAO was able to inhibit 80% of growth of yeast. CR-LAAO also showed antiparasite potential against species L. chagasi infantum (IC50 = 16.66 µg/mL) and L. braziliensis (IC50 = 24.47 µg/mL) and inhibited the growth of Trypanosoma cruzi promastigote form (IC50 = 196.8 µg/mL). In vivo tests revealed that CR-LAAO promotes acute local inflammation by recruiting inflammatory cells as neutrophils and by inducing the production of cytokines (IL-6 and IL-1β) and lipid mediators (PGE2 and LTB4). The results suggest that CR-LAAO presents evident biotechnological potential, with antiparasite, fungicidal, bactericidal and antitumor effects in vitro. Thus, the results obtained for CR-LAAO provide important information for the development of therapeutic strategies with directed action, such as more effective chemotherapeutic and antimicrobial agents.
doi:10.11606/t.60.2014.tde-17042015-152434 fatcat:r3qynaniqvb5tcaesk2dwnicc4