1 Imunologijos institutas, Moltų pl. 29, 2021 Vilnius, tel. 8-22 469249 2 Lietuvos veterinarijos institutas, Instituto g. 2, 4230 Kaišiadorys, tel. 8 346 60691; el. paštas: arusta@one.lt 3 Lietuvos veterinarijos akademija, Tilžs g. 18, 3022 Kaunas. Santrauka. Vieno mgintuvlio lizdin AT-PGR buvo pritaikyta greitam galvijų virusins diarjos viruso (GVDV) ir klasikinio kiaulių maro viruso (KKMV) nustatymui ir diferencijavimui. Šių tyrimų tikslas-išbandyti supaprastintą atvirkštins transkripcijos

more »

... dinę polimerazs grandininę reakciją (AT lizdin PGR) GVDV ir KKMV diagnostikoje. Šiam tikslui bendra RNR buvo išskirta iš virusais užkrstų ląstelių kultūrų ir iš viso EDTA stabilizuoto kraujo. Penki mikrolitrai RNR buvo transkribuoti ir amplifikuoti dviem metodais: standartiniu, trijų etapų ir modifikuotu vieno uždaro mgintuvlio. Kiekvienam metodui buvo panaudoti du oligonukleotidų rinkiniai. Pirmasis buvo specifiškas visiems pestivirusams ir komplementarus 5'-UTR pestivirusų genomo regionui. Antrasis, sudarytas iš E2 proteiną koduojančios regiono nukleotidų sekų, buvo naudojamas diferencijuoti KKMV nuo GVDV. Standartinis metodas, susidedantis iš trijų etapų, atliktas 3 skirtinguose mgintuvliuose: AT, PGRI ir lizdin PGR. Vieno mgintuvlio lizdins PGR visi trys etapai buvo atliekami uždarytame mgintuvlyje. Šiam metodui AT-PGRI reagentai buvo sudedami į mgintuvlio dugną, tuo tarpu lizdins PGR komponentai imobilizuojami mgintuvlio dangtelyje, panaudojant polisacharidą trechalozę. Užbaigus AT-PGRI etapą, mgintuvlis buvo keletą kartų pavartomas, trumpai nucentrifuguojamas ir toliau atliekama lizdin PGR. Tyrimai įrod, kad vieno uždaro mgintuvlio AT lizdins PGR metodas buvo labai jautrus ir mažiau linkęs į klaidingai teigiamus tyrimų rezultatus, lyginant su standartine AT lizdine PGR arba AT-PGRI. Šis metodas galtų pagerinti jau egzistuojančias AT-PGR nustatant GVDV ar KKMV. Summary. A single tube nested RT-PCR was developed for rapid detection and identification bovine viral diarrhea virus (BVDV) and classical swine fever virus (CSFV). The aim of the study was to apply the simplified procedure of reverse transcription and polymerase chain reaction (RT nested PCR) for diagnosis BVDV and CSFV. Total RNA was extracted from virus-containing cell culture supernatant and whole EDTA blood. Five microliters of RNA were reversely transcribed and amplified by two methods: standard, three steps and modified closed one-tube. Two sets of PCR primers were used for each method. The first, based on 5'UTR of pestivirus genome, was specific for all pestiviruses. The second, designed on E2 protein-coding region was used for specifically differentiate CSFV from BVDV. The standard method consisting of 3 steps was performed in 3 separate reaction tubes: RT, PCR, nested PCR. In the single-tube method all three steps were performed in a single closed tube. In this method reagents for RT-PCR step were deposited in tube bottom, while re-agents for nested PCR were immobilized in a tube cap using carbohydrate trehalose. After the RT-PCR step was completed the tube was vortexed, centrifuged and the nested PCR was performed. It was concluded that the closed one tube RT-nested PCR method was very sensitive and less prone to giving false positive results compared to standard RT-nested PCR or RT-PCRI, carried out in separate reaction tubes. This method could be an improvement over existing RT-PCR assays for BVDV and CSFV.