Korelacija bioloskih aktivnosti sintetisanih derivata 4-hidroksikumarina i njihovih fizicko-hemijskih parametara [thesis]

Milan Mladenovic
ИЗВОД Серија од седамнаест деривата 4-хидроксикумарина, супституисаних у положају 3 поларним функционалним групама, тестирани су као антимикробни, антиоксидативни и антикоагулативни агенси. Антимикробна активност тестираних деривата 1-10с одређена је дилуционом методом у in vitro условима при чему су деривати показали умерену активност. Антиоксидативна активност in vitro деривата 1-10с одређена је констатовањем тоталног антиоксидативног капацитета, способности неутрализације DPPH, пероксидног и
more » ... хидрокси радикала и хелатизационог капацитета тестираних агенаса, при чему су сви деривати показали изразиту антиоксидативну активност. Антикоагулативна активност in vivo деривата 1-10с испитивана је након интраперитонеалне апликације деривата на лабораторијским пацовима Wistar соја и мерењем протромбинског времена. Деривати 1-10с показали су одличну антикоагулативну активност након вишедневне апликације, нису изазвали инфламацију нити промене на јетри животиња. Биолошки резултати су, након оптимизације једињења молекулско-механичким и квантно-механичким методама, поређени са њиховим физичко-хемијским параметрима, односно молекулским дескрипторима, што је резултовало формирањем осам статистички значајних 1D-QSAR једначина које су обухватиле студије антимикробне (три једначине) и антиоксидативне активности (пет једначина), односно два статистички значајна 3D-QSAR модела који су обухватили студије антикоагулативне активности. QSAR студије искоришћене су при дизајну четрдесет шест нових активнијих деривата. Антимикробна активност предвиђена је за десет нових деривата, антиоксидативна за двадесет, док је за шеснаест нових деривата предвиђен ниво антикоагулативне активности. QSAR студије употпуњење су и студијама хомологог моделовања, молекулског доковања и DFT механистичким студијама у циљу додатног објашњења високе активности тестираних деривата. SUMMARY The series of seventeen 4-hydroxycoumarin derivatives, substituted at C-3 position with high polar scaffolds, were evaluated as antimicrobial, antioxidant and anticoagulant agents. The in vitro antimicrobial activity of compounds 1-10с was determined using the dilution method. During the evaluation of antimicrobial activity, coumarin derivatives showed moderate potential. The compounds 1-10с antioxidant activity in vitro was determined using Total antioxidant capacity assay, DPPH radical scavenging assay, Lipid peroxidation in linoleic acid emulsion inhibition assay, Hydroxyl radical scavenging activity assay and Ferrous ion chelating ability assay. During the evaluation of antioxidant activity, coumarin derivatives presented excellent activity. The anticoagulant activity in vivo was evaluated after the continuous intraperitoneal administration of compounds 1-10с to adult Albino Wistar rats and by measuring the prothrombin time. Administrated compounds presented excellent anticoagulant activity and induced no inflammation or change to the animal liver. Biological results were correlated with various molecular descriptors, obtained after molecular-mechanic and quantum-mechanic optimization of coumarin compounds, which led to eight statistically significant 1D-QSAR equations, describing the antimicrobial (by three equations) and antioxidant activity (by five equations), and two statistically significant 3D-QSAR models describing the anticoagulant activity. Obtained QSAR model were used for design of fourthly six new derivatives with improved activity. The antimicrobial activity was predicted for ten new compounds, the antioxidant ability for twenty more, while the anticoagulant activity was proposed for sixteen new derivatives. QSAR studies were accompanied with homology modeling and molecular docking studies, as well with the DFT mechanistic studies which were all used for describing the high biological activity of tested compounds. САДРЖАЈ ИЗВОД SUMMARY 1. ОПШТИ ДЕО 1 1.1. Кумарини као биохемијски активна једињења 3 1.2. Биолошка активност кумарина 10 1.2.1. Антимикорбна активност кумарина 13 1.2.2. Антиоксидативна активност кумарина 22 1.2.3. Антикоагулативна активност кумарина 27 1.3. Метаболизам кумарина 37 1.4. Компјутационе методе одређивања биоактивних конформација кумарина 39 1.5. Методе дескрипције утицаја фармакофора у молекулима кумарина на биолошку активност 43 2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 45 2.1. Преглед синтетичких деривата 4-хидроксикумарина укључених у QSAR студије 47 2.2. Припремни поступци за одређивање антимикробне активности деривата 4-хидроксикумарина у in vitro условима 52 2.2.1. Засејавање култура на косу чврсту подлогу 53 2.2.2. Припремање суспензије (инокулума) спора одређене концентрације 53 2.3. Одређивање антимикробне активности деривата 4хидроксикумарина макродилуционом методом у in vitro условима 55 2.4. Kомпјутационе методе одређивања вредности молекулских дескриптора и развоја QSAR студија антимикробне активности 56 2.4.1. Молекулска динамика 57 2.4.2. Молекулска оптимизација 58 2.4.3. Молекулски дескриптори 61 2.4.4. QSAR студије антимикробне активности 62 2.4.5. Молекулско доковање 65 2.5. Методе одређивање антиоксидативне активности испитиваних деривата 4-хидроксикумарина у in vitro условима 65 2.5.1. Одређивање укупног антиоксидативног капацитета фосфомолибденском методом 66 2.5 2. Одређивање антиоксидативне активности DPPH методом 68 2.5.3. Одређивање инхибиције липидне пероксидације амонијумтиоцијанатном методом 69 2.5.4. Одређивање способности неутрализације хидроксил радикала 70 2.5.5. Одређивање хелатизационог капацитета 70 2.6. Kомпјутационе методе одређивања вредности молекулских дескриптора и развоја QSAR студија антиоксидативне активности 71 2.6.1. Молекулска динамика 71 2.6.2. Молекулска оптимизација 72 2.6.3. Молекулски дескриптори 76 2.6.4. QSAR студије антиоксидативне активности 76 2.7. Поступци за одређивање антикоагулативне активности у in vitro и in vivo условима 76 2.7.1. Одређивање антикоагулативне активности in vitro 76 2.7.2. Одређивање антикоагулативне активности in vivo 77 2.8. Kомпјутационе методе одређивања вредности молекулских дескриптора и развоја 3D-QSAR студија антиикоагулативне активности 80 2.8.1. Молекулска динамика 81 2.8.2. Преклапање молекула и формирање CoMFA и CoMSIA 3D-QSAR модела 82 2.8.3. 3D-QSAR студија антикоагулативне активности in vivo 83 2.9. Механистичке студије антикоагулативне активности in vivo кумаринских деривата DFT методом 85 2.9.1. Хомолого моделовање VKORC1 пацова 85 2.9.2. Молекулско доковање 86 2.9.3. Механистичке студије инхибиције VKORC1 кумаринским дериватима DFT методом 87 2.10.9. Одређивање концентрације албумина (колориметријском методом на 628 nm) 95 3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 97 3.1. Испитивање биохемијскe активности деривата кумаринaпреглед хемијске структурe 99 3.2. Антимикробна активност деривата 4-хидроксикумарина испитивана у in vitro условима методом двоструког разблажења 101 3.3. QSAR студије антимикробне активности 103 3.4. Антиоксидативна активност деривата 4-хидроксикумарина у in vitro условима 115 3.4.1. Укупан антиоксидативни потенцијал 115 3.4.2. Одређивање способности неутрализације DPPH радикала 116 3.4.3. Инхибиција липидне пероксидације у емулзији линолеинске киселине 120 3.4.4. Одређивање способности неутрализације хидрокси радикала 122 3.4.5. Хелатизациони капацитет 124 3.5. QSAR студије антиоксидативне активности 126 3.6. Антикоагулативна активност кумаринских деривата 136 3.6.1. In vitro антикоагулативна активност 136 3.6.2. In vivo антикоагулативна активност 137 3.6.3. Одређивање метаболичких путева најактивнијих кумаринских деривата 139 3.7. QSAR студије антикоагулативне активности 140 3.8. Компјутационе студије механизма антикоагулативне активности у in vivo условима 149 3.9. Биохемијски параметри серума и плазме лабораторијских животиња након апликације in vivo деривата кумарина 154 4. ЗАКЉУЧАК 157 5. ЛИТЕРАТУРА 165 6. ПРИЛОЗИ 177 Табела 1. Оптичка густина у функцији густине инокулума спора 54 Табела 2. Структура С-3 остатака испитиваних деривата 4-хидроксикумарина 100 Табела 3. MIC (µg/mL) вредности антимикробне активности деривата 1-8b 102 Табела 4. MIC (µg/mL) и -LogMIC вредности антимикробне активности деривата 1-8b и 2-10c које су коришћене при развоју QSAR студија 103 Табела 5. Вредности молекулских дескриптора деривата 1-10c коришћених у QSAR судијама антимикробне активности 104 Табела 6. Парцијална атомска наелектрисања фармакофора деривата 1-10c коришћених у QSAR студијама антимикробне активности 105 Табела 7. Корелациона матрица мерене антимикробне активности и молекулских дескриптора деривата 1-10с 109 Табела 8. Поређење MIC експерименталних резултата антимикробне активности деривата 1-10с са резултатима QSAR студија 110 Табела 9. Тотална актиоксидативна активност деривата 1-10с и способност неутрализације DPPH радикала 119 Табела 10. Способност инхибиције липидне пероксидације, неутрализације хидрокси радикала и хелатизације феро-јона деривата 1-10с 125 Табела 11. Енталпије дисоцијације 4-ОН везе и вредности молекулских дескриптора деривата 1-10с коришћених у QSAR студијама антиоксидативне активности 126 Табела 12. Корелациона матрица вредности молекулских дескриптора деривата 1-10с и антиоксидативне активности 133 Табела 13. Однос измерених и израчунатих вредности антиоксидативне активности деривата 1-10с након QSAR студија 134 Tабела 14. Aнтикоагулативнa активност кумаринских деривата 1-10с in vitro и in vivo (након 24 h и петодневног третмана). 138 Табела 15. Резултати CoMFA и CoMSIA регресионе анализе и предвиђене IC 50 и pIC 50 ново дизајнираних једињења 148 Табела 16. Хепатотоксична активност кумаринских деривата 1-10с и статус јетре након 24 h и петодневне апликације у концентрацији 0,5 mg/kg телесне масе 155 Табела 17. Тотална антиоксидативна активност деривата 1-8b 176 Табела 18. Измерене апсорбанце раствора приликом неутрализације DPPH радикала дериватима 1-8b након 30 и 60 мин 177 Табела 19. Измерене апсорбанце раствора приликом неутрализације DPPH радикала дериватима 2-10c након 30 и 60 мин 178 Табела 20. Инхибиција липидне пероксидације дериватима 1-10с након 24 сата 179 Табела 21. Инхибиција липидне пероксидације дериватима 1-10с након 48 сати 180 Табела 22. Инхибиција липидне пероксидације дериватима 1-10с након 72 сата 181 Табела 23. Измерене апсорбанце и израчунати проценти инхибиције хидроксил радикала за деривате 1-10с 182 Табела 24. Измерене апсорбанце и израчунати проценти хелатизационог капацитета за деривате 1-10с 183 Схема 1. Интрамолекулска резонантна стабилизација кумаринског молекула 3 Схема 2. Електрон акцепторско дејство карбонилне групe на молекул кумарина 4 Схема 3. Кето-енолна таутомерија молекула 4-хидроксикумарина 4 Схема 4. Биосинтеза шикимске и префенске киселине 5 Схема 5. Биосинтеза кумарина и 7-хидроксикумарина из префенске киселине 6 Схема 6. Биосинтеза 4-хидроксикумарина 8 Схема 7. Anschutz -ова синтеза 4-хидроксикумарина 9 Схема 8. Boyd-Roberston-ова синтеза 4-хидроксикумарина 9 Схема 9. Zeigler-Junek-ова синтеза 4-хидроксикумарина 9 Схема 10. Синтеза 4-хидроксикумарина без присуства растварача 10 Схема 11. Mentzer-Vercier-ова синтеза 3-супституисаног 4-хидроксикумарина 10 Схема 12. Бисинтеза кумаринског прстена у новобиоцину 16 Схема 13. Каскадни механизам коагулације крви 29 Схема 14. Механизам активације фактора II, VII, IX и X витамином К 30 Схема 15. Антикоагулативна активност варфарина на нивоу витамин К-епоксид редуктазе 34 Схема 16. Прва фаза метаболизма кумаринског језгра 37 Схема 17. Друга фаза метаболизма кумаринског језгра 38 Схема 18. Преглед хемијске синтезе и хемијске структуре деривата 4хидроксикумарина коришћених у експерименталном делу 47 Схема 19. Редукција ресазурина у анаеробним условима 56 Схема 20. Дизајнирани кумарински деривати са предвиђеним вредностима антимикробне активности 113 Схема 21. Механизам неутрализације DPPH˙ радикала антиоксидантом 117 Схема 22. Механизам липидне пероксидације и инхибиторско дејство антиоксиданта 120 Схема 23. Деградација 2-деоксирибозе након абстракције хидроксилног радикала и механизам инхибиције антиоксидантом 122 Схема 24. Инхибиција настанка гвожђе-ферозин комлекса антиоксидантом 124 Схема 25. Дизајнирани деривати 4-хидроксикумарина са предвиђеном антиоксидативном активношћу in vitro 135 Схема 26. Предложени метаболички путеви 2b и 4c 140 Схема 27. Структуре новодизајнираних кумаринских антикоагуланата 147 Схема 28. Предложени механизам антикоагулативне активности кумарина 150 Слика 1. Кумаринско језгро 3 Слика 2. Структуре биолошки активних кумарина 11 Слика 3. Новобиоцин и водоничне везе које остварује у активном центру ДНКгиразе; кристална структура новобиоцина у комплексу са Nтерминалним фрагментом ДНК-гиразе Б E. coli, масе 24 kDа 18 Слика 4. Модификоване структуре новобиоцина активне на S. aureus 19 Слика 5. Ферунелол 20 Слика 6. Најактивнији антимикробни хетероарил дериват 4-хидроксикумарина 20 Слика 7. С-3 (Е)-4-фенилбут-3-ен-2-он 4-хидроксикумарини са антимикробном активношћу 21 Слика 8. 4-хидроксикумарин супституисан 1-ноненом на положају С-3 са антимикробном активношћу 21 Слика 9. Триазил деривати 4-метоксикумарина са антимикробном активношћу 21 Слика 10. S-триазинил уреа и тиоуреа деривати 4-хидроксикумарина са антимикробном активношћу 22 Слика 11. N-изопропил-3-нитроанилин дериват 4-хидроксикумарина са антиоксидативном активношћу 26 Слика 12. S-3 (Е)-4-фенилбут-3-ен-2-он 4-хидроксикумарини са антиоксидативном активношћу 26 Слика 13. 3-карбоксиамини 4-хидроксикумарини као инхибитори липидне пероксидације 26 Слика 14. 7-азометин деривати 4-хидроксикумарина као инхибитори липидне пероксидације 26 Слика 15. Етил-2-ацетил-3-фенyлбутаноат С-3 4-хидроксикумарини као антиоксиданти 27 Слика 16. Структура варфарина 32 Слика 17. Кристална структура варфарина и таутомерни облици у воденом раствору 33 Слика 18. Синтетички антикоагуланти хемијски слични варфарину 35 Слика 19. Пиридински, пиперидински и пиразолови деривати 4-хидроксикумарина као антикоагуланти 36 Слика 20. Арил деривати варфарина као антикоагуланти 36 Слика 21. Деривати дикумарола као антикоагуланти 36 Слика 22. Прва фаза метаболизма варфарина 38 Слика 23. Површина потенцијалне енергије 42 Слика 24. Корелација експерименталних и израчунатих вредности антимикробне активности деривата 1-10c код S. aureus 106 Слика 25. Корелација експерименталних и израчунатих вредности антимикробне активности деривата 1-10c код E. Coli 108 Слика 26. Корелација експерименталних и израчунатих вредности антимикробне активности деривата 1-10c код C.albicans 109 Слика 27. Конформација најактивнијих деривата кумарина 3b и 9c у активном центру ДНК-гиразе 111 Слика 28. Конформација најактивнијих дизајнираних деривата кумарина 1d, 2d, 5d и 7d у активном центру ДНК-гиразе 114 Слика 29. График зависности инхибиције DPPH радикала у односу на концентрацију деривата 1-10с након 60 минута 118 Слика 30. График зависности инхибиције хидроксил радикала у односу на концентрацију деривата 1-10с 123 Слика 31. Формирање Fe 2+ -ферозин комплекса 124 Слика 32. Корелација експерименталних и израчунатих вредности способности неутрализације DPPH радикала дериватима 1-10с 128 Слика 33. Корелација експерименталних и израчунатих вредности способности неутрализације пероксидног радикала дериватима 1-10с 129 Слика 34. Енолизована хидроксилна група на положају 4 једињења a) 6b и г) 4c; HOMO орбитале једињења б) 6b и д) 4c; LUMO орбитале једињења в) 6b и ђ) 4c 130 Слика 35. Корелација експерименталних и израчунатих вредности способности неутрализације хидроксил радикала дериватима 1-10с 132 Слика 36. Корелација експерименталних и израчунатих вредности способности хелатизације феро-јона дериватима 1-10с 133 Слика 37. Aтом-по-атом преклапање конформација 1-10с 140 Слика 38. Корелација експерименталних и предвиђених рIC 50 вредности тренинг сета (квадрати) и тест сета (кругови) CoMFA методом 141 Слика 39. CoMFA контуре a) стерних и в) електростатичких мапа 2b; б) стерних и г) електростатичких мапа 4c 142 Слика 40. Корелација експерименталних и предвиђених pIC 50 вредности тренинг сета (квадрати) и тест сета (троуглови) CoMSIA методом 143 Слика 41. CoMSIA a) стерна, б) електростатичка и в) поља акцептора водоничних веза 2b; г) стерна, д) електростатичка и ђ) поља акцептора водоничних веза 4c 144 Слика 42. a) Поравњавање структура бактеријског и VKORC1 пацова; б) секундарна структура VKORC1 пацова; в) траснмембранска структура VKORC1 пацова 145 Слика 43. Конформације једињења a) 2b и б) 4c унутар активног центра VKORC1 пацова 146 Слика 44. DFT механистичке студије механизма антикоагулативног деловања 2b 152 Слика 45. DFT механистичке студије механизма антикоагулативног деловања 4c 153 1. ОПШТИ ДЕО 2 Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 3 1.1 Кумарини као биохемијски активна једињења Хемија кумарина. Молекули α-пирона кондензовани са бензеновим прстеном називају се кумарини (Слика 1). По IUPAC номенклатури, основни кумарински молекул назива се 2Н-хромен-2-он, док се као атом на положају 1 обележава кисеоник из пиронског дела молекула. Хемијске особине молекула кумарина условљене су присуством лактонске структуре, двогубе везе α-пирона и ароматичног прстена. Слика 1. Кумаринско језгро У реакцијама електрофилне супституције кумарини се понашају као ароматична једињења, при чему се електрофилни реагенси везују за бензенов прстен који подлеже реакцијама нитровања, сулфоновања или диазотовања, најчешће у положајима С-6 и С-8 [1]. Овако диригована електрофилна супституција кумаринског аромата последица је интрамолекулске резонанционе стабилизације и присуства позитивног наелектрисања на бензеновом прстену (Схема 1): Схема 1. Интрамолекулска резонантна стабилизација кумаринског молекула Двострука веза 3,4-пиронског система у коњугацији са карбонилном групом чини јединствен систем у хемији. Електрон акцепторски карактер карбонилне групе доприноси смањењу електронске густине угљениковог атома на положају С-4 и њеном померању у смеру карбонилне групе. Због тога, С-4 постаје електрофилни а С-3 нуклеофилни центар пиронског прстена (Схема 2). Присуство неке електрон донорске групе у положају С-4, појачава нуклеофилност угљениковог атома у положају С-3. Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 4 Схема 2. Електрон акцепторско дејство карбонилне групе 4-Хидроксикумарин, чији су деривати и њихова биолошка активност предмет ове докторске дисертације, по хемијским особинама се разликују како од самог несупституисаног кумарина, тако и од осталих хидроксикумарина. Разлог је у постојању кето-енолне таутомерије хидроксилне групе и настанку β-кетоестарског система који знатно стабилизује кумарински прстен, повећавајући му ароматичност (Схема 3). Схема 3. Кето-енолна таутомерија 4-хидроксикумарина Бензенов прстен 4-хидроксикумарина мање је реактиван од обичног или кумаринског бензена, док α-пиронски прстен под врло благим реакционим условима ступа у реакције супституције на положају С-3. Услед присуства хидроксилне групе, положај С-3 је реактиван, како према електрофилним, тако и према нуклеофилним агенсима [2,3]. Биосинтеза кумарина у биљкама. Кумарини су секундарни метаболити биљака и спадају у групу природних ароматичних једињења. Биосинтетишу се углавном у вишим биљкама из фамилија Apiaceae, Asteraceae, Fabaceae, Rutaceae и Umbelliferatae [4] a велика концентрација кумарина присутна је у зеленом чају и воћу. Основни пут биосинтезе кумаринa одвија се преко пута биосинтезе шикимске киселине и њене трансформације до префенске киселине (Схема 4) [5]. Биосинтеза шикимске киселине јесте заједнички пут биосинтезе природних ароматичних једињења након процеса фотосинтезе. Пут шикимске киселине обухвата низ метаболичких трансформација шикимата из кога настају и кинска киселина (преко дехидрокинске киселине), протокатехинска и гална киселина (преко 5-дехидрошикимске киселине), 2сукцинилбензоева киселина (преко хоризминске киселине) из које даље настају ализарин Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 5 и филохинони, хомогентизинска киселина (прекурсор пластохинона), р-кумаринска киселина и други секундарни биомолекули [5]. У даљем тексту ће детаљно бити представљена биосинтеза кумаринског језгра (Схеме 4, 5 и 6). Биосинтеза кумарина започиње ароматизацијом шикимске киселине (Схема 4). Киселина се активира под дејством шикимат-киназе увођењем фосфатног остатка на положају С-5. Из активираног облика, реакцијом са фосфоенолпируватом, под дејством 5фосфоенолпирувилшикимат-5-фосфат-синтазе, преко интермедијерног облика III настаје 3-енолпирувилшикимат-5-фосфат. Овај секундарни молекул је прекурсор хоризминске киселине која настаје елиминацијом ортофосфата са положаја С-5. Схема 4. Биосинтеза шикимске и префенске киселине Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 6 Ензим који катализује конверзију је хоризмат-синтаза. Хоризминска киселина у прстену садржи две коњуговане двогубе везе; прва настаје интрамолекулским премештањем унутар прстена шикимата а друга елиминацијом протона са положаја С-2. Коњугација се прекида дејством хоризмат-мутазе која катализује и премештање угњеничног низа бившег фосфоенолпирувата са положаја С-3 на положај С-2. Производ који настаје је префенска киселина, први прави прекурсор кумарина. Метаболички пут префенске киселине обухвата елиминацију преостале хидроксилне групе из прстена под дејством префенат-дехидратазе (Схема 5). Схема 5. Биосинтеза кумарина и 7-хидроксикумарина из префенске киселине Последица елиминације је увођење треће двогубе везе у прстен и формирање ароматичног кумаринског молекула. Уз реакцију елиминације врши се и реакција декарбоксилације Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 7 остатка фосфоенолпирувата и формирања фенилпирогрожђане киселине која реакцијом трансаминације постаје L-Phе. Уведена амино група је супстрат амонијачне лиазе чијим се дејством добија бочна двострука веза, уз елиминацију амонијака. Настали производ се назива trans-циметна киселина и природни је супстрат за добијање кумаринског молекула. Киселина се трансформише увођењем о-хидроксилне групе дејством ензима циметат-4хидроксилазе ензима из групе CYT P450. Истовремено се врши и изомеризација transдвоструке везе у cis-након чега се одвија интрамолекулска лактонизација cis-окумаринске киселине и настанак кумаринског језгра. Алтернативни метаболички пут префенске киселине јесте њена редукција до рхидроксифенилпирогрожђане киселине под дејством префенат-дехидрогеназе (Схема 5). Редукција је праћена и декарбоксилацијом. Остале реакције су аналогне основном метаболичком путу префената. Након трансаминације р-хидроксифенилпирувата добија се аминокиселина L-Tyr, која се потом катаболише до trans-р-кумаринске киселине. Њеном лактонизацијом, после увођења хидроксилне групе и изомеризације двогубе везе, биосинтетише се 7-хидроксикумарин, односно умбелиферон. На почетку текста о биосинтези је напоменуто да се кумарини преференцијално биосинтетишу у биљкама. Међутим, 4-хидроксикумарин има другачији пут биосинтезе јер га биљке биосинтетишу само у синергији са гљивама (Схема 6) [6]. Биосинтеза 4хидроксикумарина није нормалан физиолошки процес, као што је то биосинтеза кумарина и умбелиферона, већ започиње након руптуре ћелије биљке. Приликом труљења слатке детелине (Melilotus albus; Fabaceae) констатована је синергија са гљивама Penicilium и Aspergillus и измена метаболичког пута trans-циметне киселине (Схема 6). Она се хидроксилује до trans-о-кумаринске киселине и активира једним молекулом ацетилкоензима А. На trans-о-кумароил-КоА врши се адиција хидроксилне групе на егзогену двогубу везу при чему настаје 3-хидроксимелиотоил-КоА. Оксидацијом уведене хидроксилне групе на положају С-3 настаје 3-оксо-мелиотоил-КоА, природни супстрат за биосинтезу 4-хидроксикумарина. Након енолизације, из cis-енол-3-оксо-мелиотоил-КоА интрамолекулском лактонизацијом настаје 4-хидроксикумарин. Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 8 Схема 6. Биосинтеза 4-хидроксикумарина Забележен је и пут биосинтезе 4-хидроксикумарина који не полази од шикимске киселине. Наиме, у синергији Melilotus albus и гљиве Sorbus aucuparia нотиран је ензим бифенил-синтаза који катализује адицију малонил-КоА на салицилат-КоА а чији је производ 3-оксо-мелиотоил-КоА (Схема 6) из кога настаје 4-хидроксикумарин. Даља хидроксилација свих презентованих кумаринских молекула одвија се у метаболичким процесима кумарина и биће предмет излагања у даљем тексту. Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 9 Хемијска синтеза кумарина. Описан је велики број метода за синтезу кумаринског молекула од којих већина обухвата кондензацију супституисаног фенола и деривата дикарбонских киселина [7-12]. Прву синтезу 4-хидроксикумарина [13] извршио је Anschutz 1903. године полазећи од хлорида ацетсалицилне киселине и диетилестра малонске киселине (Схема 7). Схема 7. Anschutz-ова синтеза 4-хидроксикумарина Сличну реакцију, полазећи од метилестра салицилне киселине извели су Pauly и Lockermann [14]. Ј. Boyd и А. Robertson [15] добили су 4-хидроксикумарин кондензацијом о-хидрокси-метилбензоата са диетилестром угљене киселине (Схема 8). Схема 8. Boyd-Roberston-ова синтеза 4-хидроксикумарина Деловањем безводног алуминијум-трихлорида на фенилмалонат, на повишеној температури, E. Zeigler и H. Junek, синтетисали су 4-хидроксикумарин [16] (Схема 9). Схема 9. Zeigler-Junek-ова синтеза 4-хидроксикумарина Модерно схватање синтезе 4-хидроксикумарина не разликује се у многоме у стратегији саме синтезе од првих изведених реакција јер се као полазни сусптрат готово увек користи супституисани фенол. Тако је малу модификацију Boyd-Robertson-ове методе Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 10 извео Kasabe са сарадницима, добивши 4-хидроксикумарин кондензацијом охидроксиацетофенона са диетилестром угљене киселине, у присуству металног натријума, на повишеној температури [17]. Коришћењем ригорознијих реакциониих услова, услед присуства натријум-хидрида и хлороводоничне киселине у толуену као растварачу, Zhao и сарадници су наведену рекацију кондензације довели до високог приноса [18]. У модерном стремљењу ка зеленој хемији, односно хемијским реакцијама без присуства растварача, Gao и сарадници развили су методу синтезе 4-хидроксикумарина (Схема 10) кондензацијом фенола и Мелдрумове киселине, (2,2-диметил-1,3-диоксан-4,6дион) у присуству Итоновог реагенса (7%-тни фосфорпентоксид у метансулфонској киселини) [19]. Производ се добија у високом приносу. Схема 10. Синтеза 4-хидроксикумарина без присуства растварача Једну од првих синтеза 3-сусптитуисаних деривата 4-хидроксикумарина, који су и предмет испитивања у овој дисертацији извели су Mentzer и Vercier [20] кондензацијом αсуспституисаног диетилестра малонске киселине и фенола у екстремним температурним реакционим условима (Схема 11). Схема 11. Mentzer-Vercier-ова синтеза 3-супституисаног 4-хидроксикумарина 1.2. Биолошка активност кумарина Кумарински деривати, природног и синтетичког порекла, предмет су интензивних фармаколошких испитивања и до сада су, као резултат, дефинисани многобројни видови Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 11 њихове активности. Готово да не постоји фармаколошко деловање које није констатовано код кумаринских деривата и због тога се за кумарине каже да су елитна класа секундарних биомолекула. Кумарински деривати су на основу структуре подељени у четири велике групе (Слика 2) [21]: 1. Прости кумарини, који обухватају најчешће 7-хидрокси, гликозидне, алкокси и алкил форме основног кумаринског молекула, 2. Фуранокумарини, линеарни или ангуларни деривати кумарина супституисани фуранским прстеном и њихови деривати и хомолози, 3. Пиранокумарини, линеарни или ангуларни деривати кумарина супституисани пиранским прстеном или његовим дериватима или биоизостерима, 4. Пирон-сусптитуисани кумарини, деривати сусптитуисани на пиранском прстену на положајима С-3 или С-4 (деривати 4-хидроксикумарина се сврставају у ову групу). Слика 2. Структуре биолошки активних кумарина Не постоји егзактна корелација зависности биолошке активности у односу на структуру кумаринских деривата обзиром да често деривати који се истовремено могу Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 12 сврстати у две или више група, показазују више од једне биолошке активности. Кумарини су тако окарактерисани као антиартеросклеротични, антиинфламаторни, антиканцерогени, антикоагулативни, антимикробни, антиоксидативни и анти-HIV агенси, затим као вазодилататори и стимулатори централног нервног система, итд. По физиолошком значају, одмах након антиканцерогене, антимикробне, антиоксидативне и антикоагулативне активности јесте инхибиција активности моноамино-оксидаза. Ипак, дефинисани су поједини структурни аспекти као предуслови биолошке активности кумарина. Тако је присуство једне хидроксилне групе, најчешће у положају С-7, односно више њих, предуслов антиканцерогене и антиоксидативне активности. Хидроксилна група на положају С-4 и хидрофобни остатак на положају С-3 предуслов су антикоагулатине активности. Супституција положаја С-3 често је предуслов антимикробне активности, док је постојање пиранског прстена предуслов анти-HIV активности. Прости кумарини, умбелиферон и његови алкил деривати [22] као и кондензати који су у положају С-3 сусптитуисани арилиден-β-кетоестрима [23] показују висок ниво антиканцерогене активности. Антиканцерогену активност испољавају и деривати кумаринског молекула сусптуисани у положају С-3 са 4,5-дихидропиразолом [24] и Nарил сулфонамидима [25]. Прости кумарини код којих је хидроксилна група у положају С-7 сусптитуисана бензил групом а положај С-3 дериватизован неком поларном групом су изузетни МАО-А и МАО-Б инхибитори, односно лекови против Паркинсонове болести [26]. Клинички инхибитор МАО-Б је геипаварин [27]. Фуранокумарин псорален и његови деривати јесу антиканцерогени агенси [28] и инхибитори моноаминооксидазе [29]. Димери фуранокумарина јесу потентни инхибитори активности CYP3А4 [30]. Пиранокумарини своју физиолошку активност испољавају као антиканцерогени агенси уз постојање бензопирано[3,2-ц]хромен-6,8-дионске структуре, прстена затвореног кондензацијом 4-хидрокси групе и карбонилног остатка на положају С-3 као неопходног структурног фрагмената [31]. Два пиранокумарина, (+)-каланолид А и (-)-каланолид Б, супституисани додатним 3,6-дихидропираном у положајима С-5 и С-6, односно пропил Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 14 1. Инхибицијом синтезе ћелијског зида (β-лактами), 2. Инхибицијом функције цитоплазматске мембране (полимиксими), 3. Инхибицијом синтезе протеина на нивоу рибозома (аминогликозиди, тетрациклини, хлорамфеникол, макролиди), 4. Инхибицијом синтезе и репликације нуклеинских киселина (хинони, хинолони и кумарини), 5. Метаболичком инхибицијом (ПАБА, триптамин). Изналажење нових антимикробних једињења јесте константна потреба услед све веће резистентости сојева микроорганизама на постојеће терапеутике, осим у дозама леталним за хуману јединку [37]. Резистенција је нарочито изражена код култура S. aureus, E. coli и C. albicans. Култура S. aureus је G+ бактерија и један од најчешћих изазивача интрахоспиталних инфекција. Изазива пиогена обољења коже, поткожног ткива, дубоких ткива и органа као и токсемична обољења. Посебну пажњу изазивају метицилин резистентни сојеви S. aureus (MRSA) који показују отпорност на пеницилинске препарате и чије су инфекције често леталне. Култура E. coli јесте G-бактерија која изазива екстраинтестиналне инфекције и дијарејна обољења или ентероколитис. Култура C. albicans је диплоидна гљива и чест је узрочник оралних и гениталних инфекција код људи. Системске гљивичне инфекције, фунгемије, јесу данас важан узрочник морталитета код пацијената којима је значајно нарушен имунитет, нпр. код оболелих од сиде, након хемиотерапије, трансплатације органа или коштане сржи. Њена претерана концентрација узрокује кандидијазу. Ова болест је нарочито распрострањена код HIV-позитивних пацијената, а такође се може манифестовати и на крв у облику кандидинемије. Кумарини антимикробну активност испољавају као инхибитори формирања ДНК бактерија и гљива. Механизам антимикробног деловања је потврђен клиничком употребом новобиоцина [38], 3-аминокумаринског секундарног метаболита културе Streptomyces који делује као моћни инхибитор Б субјединице бактеријске ДНК-гиразе. Изразиту антимикробну активност испољавају и хлоробиоцин и коумермицин А1. Новобиоцин јесте дериват 4-хидроксикумарина и спада у групу пиронсупституисаних кумарина. По номенклатури то је 4-хидрокси-3-[4-хидрокси-3-(3метилбут-2-енил)бензамидо]-8-метоксикумарин-7-ил 3-О-карбамоил-5,5-ди-C-метил-α-L-Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 15 луксофуранозид (Слика 3), дериват чија је амино група на положају С-3 сусптитуисана рхидрокси-m-диметилалилбензоевом киселином док је хидроксилна група на положају С-7 суституисана шећером новиозом. Хлоробиоцин се разликује од новобиоцина по томе што је положај С-8 кумаринског прстена супституисан атомом хлора док је положај С-3' новиозе супституисан 5-метил-2-пиролкарбоксилном групом. Структура коумермицина А 1 обухвата два кумарин-новиоза скелета повезаних 3-метил-2,4-дикарбоксилпиролом, док је супституција новиозе истоветна као код хлоробиоцина. Биосинтеза кумаринског језгра новобиоцина, односно 3-амино-4,7-дихидрокси-2-Н-хромен-2-она, почиње трансформацијом L-Tyr насталог у путу префенске киселине (Схема 12). Биосинтеза кумаринског молекула почиње интеракцијом тирозина са NovH протеином бактерије који катализује везивање L-Tyr на протеински носач пептидилног остатка (PNP). Други корак биосинтезе јесте аденилација тирозина на домену А до формирања L-тирозил-AMP-a уз учешће метаболичке енергије. Активирана амино киселина потом подлеже нападу протеинског сумпора при чему се гради L-тирозил-S интермедијер који се даље преводи у L-тирозил-S-NovH-ацил ензим, супстрат за хидроксилацију и формирање хидроксилне групе у положају С-4 кумарина. Хидроксилација је катализована NADP-зависним NovI ензимом који по механизму деловања јесте монооксигеназа из групе CYTP450. Оксидоредукциона равнотежа постиже се помоћу фередоксина (Fd) и фередоксин редуктазе. Пиронска двострука веза се формира након интеракције кумаринског комплекса са редуктазама NovJ и NovК. Метил група у положају С-8 уводи се катализом NovО ензима који је по типу метилтрансфераза. Увођење лактонског кисеоника последица је оксидације кумаринског молекула FAD-ависном NovC монооксигеназом након чега се прстен затвара нуклеофилним нападом хидроксилне групе на тиоестарски карбонилни центар и настаје амино-кумарин новобиоцина. Механизам ротације двогубе везе и стереохемијска промена амино групе из trans-у cis-положај према хидроксилној групи на положају С-4 није разјашњен али се одвија уз одлазак пантетеил-PNP комплекса. Супституент амино групе се такође биосинтетише трансформацијама тирозина. Новиоза се биосинтетише кроз катаболизам глукозе. Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 16 Схема 12. Биoсинтеза кумаринског прстена у новобиоцину У бактеријама, бактериофагима, гљивама и неким вирусима који садрже ДНК, приликом расплетања нуклеотидних ланаца пре репликације, долази до додатног увијања на крају постојеће хеликоидне структуре и повећања торзионих сила у делу молекула који још није расплетен. Као резултат додатног увијања, у једном тренутку више не постоји интрамолекулски простор стабилизован водоничним везама те се крај ДНК молекула спаја у једну целину формирајући кругове, штитећи тако слободне 3' и 5' ковалентне крајеве макромолекула. Затворени кругови могу постојати у релаксираној или у "суперувијеној" (енг. supercoiling) форми [39]. "Суперувијање" настаје када се затворени кругови увијају око сопствене осе или када се увијају линеарни низови двоструких хеликса. Увијање се одвија у циљу контроле репликације ДНК и синтезе протеина. Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 18 група новиозе на положају С-2' гради водоничну везу са карбонилним кисеоником из пептидне везе Аsn46, док кисеоник С-4'-метокси групе формира интеракцију са остатком Аsn46. Аминокиселина Аsn46 остварује и стерне интеракције са метил групама са положаја С-4' и С-5'. Етарски кисеоник који повезује новобиозу са положајем С-7 кумарина је оријентисан тако да гради водоничну везу са бочним низом Glu50 а преко молекула воде. Насупрот новобиози, кумарински прстен формира само две водоничне везе, обе са гуанидном групом Аrg136. Естарски и карбонилни атоми кисеоника формирају водоничне везе дужине 3,2 и 2,6 Å. Хидроксилна група на положају С-4 не остварује интеракције са активним центром ензима. Слика 3. Новобиоцин и водоничне везе које остварује у активном центру ДНК-гиразе; кристална структура новобиоцина у комплексу са N-терминалним фрагментом ДНК гиразе Б E. coli, масе 24 kDа Додатну стабилизацију новобиоцина у активном центру ензима пружају и бројне хидрофобне интеракције. Тако су 5',5'-диметил и 4'-метокси групе шећерне компоненте антибиотика окружене хидрофобним џепом аминокиселина. Алкил остатак Arg76 лежи изнад док прстен Pro79 лежи испод равни кумаринског прстена. Остатак са амино стране молекула, 3"-изопентенил-4"-хидробензоат окружује Pro79 и он нема значајну улогу у антимикробној активности. Новиоза самостално не показује антимикробну активност. Њена активност у молекулу новобиоцина је вероватно последица интеракције кумаринског дела молекула са Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 19 аминокиселином Аrg46, којом се шећер смешта у повољан положај према ензиму. Кристална структура новобиоцин-ДНК-гираза комплекса представљена је на Слици 3 (извор: PDB ID 1АЈ6). Новобиоцин показује изразиту антибактеријску активност и према G+ и према Gбактеријама. МIC према S. aureus показује при концентрацијама од 0,01-1 μg/mL [41] те је због јаког антимикробног деловања коришћен и као клинички терапеутик против S. aureus резистенте на метицилин (MRSA). Нешто слабију активност новобиоцин пoказује код Е. coli са МIC od 32-64 μg/mL [42]. Модификацијом молекула новиозе увођењем Nпропагилоксикарбамата у положају C-3' и суптитуцијом положаја C-3 са различитим алкил дериватима Schiff-ове базе (Слика 4), добијена је активност нових деривата на ATCC сојеве и различите изолате S. aureus је у интервалу MIC од 0,04-20 μg/mL [43]. Модификацијом хлоробиоцина увођењем алкил супституената у положају С-3 и променама на прстену новиозе није дошло до повећања, већ до смањења активнoсти [44] те је токсичност деривата новобиоцина и хлоробиоцина при дужој употреби и смањена активност хемијски модификованих деривата, усмерила испитивања антимикробне активности нових кумаринских деривата из биљних и синтетичких извора. Слика 4. Модификоване структуре новобиоцина активне на S. aureus Прости кумарини дафненин, дафнин, ацетилумбелиферон и дафнорелин изоловани из Daphne gnidium L. су активни на многе културе међу којима су и S. aureus, E. сoli и C. albicans, са MIC=100-500 μg/mL [45]. Прости и фуранокумарини изоловани из биљке Prerocaulon (Asteraceae) показали су значајан антифунгални потенцијал у интервалу MIC=31,25-250 μg/mL [46]. Из биљке Ruta graveolens изоловани су умебелиферон и 7метоксиумбелиферон, 5-и 8-метоксипсорален и 4 хидроксикумарин. Изоловани деривати псоралена и фуранокумарина поседују изразиту антифунгалну активност на Fusarium Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 20 oxysporum [47]. Из биљке Ferula communis L. (Apiaceae) изоловани су деривати 4хидроксикумарина ферунелола (Слика 5) који је у положају С-3 сусптитуисан различитим пренил остацима. Деривати ферунелола показали су изразит степен инхибиције развоја Mycobacterium са MIC у интервалу 0,5-64 μg/mL [48]. Слика 5. Ферунелол Синтетички деривати кумарина показују знатно бољу антимикробну активност од деривата биљног порекла. Тако је синтетички дериват 6-(бута-1,3-диен-2-ил)-7-метокси-2Н-хромен-2-он, показао изразиту антимикробну активност у интервалу MIC=1,56-12,5 μg/mL на широк дијапазон бактерија [49]. Различити фенил деривати 3-нитрокумарина показали су антимикробну активност према S. aureus при MIC вредностима мањим од 256 μg/mL док је активност према C. albicans констатована у интервалу MIC=64-1024 μg/mL [50]. Синтетички деривати кумарина који садрже језгра фуранокумарина и пиранокумарина нису нотирани као потентни инхибитори раста микроорганизама. Супротно томе, велика пажња усмерена је ка дериватизацији 4-хидроксикумаринског молекула. Хетероарил деривати 4-хидроксикумарина (Слика 6), који по структури представљају супституисане дикумароле, тестирани су као антимикробни агенси дифузионом и дилуционом методом и на G+ културе показали активност у интервалу MIC=12,5-50 μg/mL, на G-културе, у интервалу МIC=12,5-50 μg/mL и на гљиве МIC=25-100 μg/mL [51]. Слика 6. Најактивнији антимикробни хетероарил дериват 4-хидроксикумарина Докторска дисертација-ОПШТИ ДЕО Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 21 Деривати 4-хидроксикумарина чији је положај С-3 супституисан (Е)-4-фенилбут-3ен-2-он функционалним групама (Слика 7) показали су високу антимикробну активност према S. aureus са МIC=1,9-31,25 μg/mL односно према B. subtilis са МIC=1,0-31,25 μg/mL [52]. Слика 7. С-3 (Е)-4-фенилбут-3-ен-2-он 4-хидроксикумарини са антимикробном активношћу Супституција 4-хидроксикумарина и 4,7-дихидроксикумарина ацил остацима 1нонена, 1-нонина као и виших масних киселина, стеарата и олеата, у положају С-3 довела је до значајане антимикробне активности на S. aureus у опсегу МIC=3,6-25,6 μg/mL [53]. Слика 8. 4-хидроксикумарин супституисан 1-ноненом на положају С-3 са антимикробном активношћу Значајна пажња у стратегији синтезе антимикробних једињења усмерена је ка синтези деривата 4-хидроксикумарина чији је протон у хидроксилној групи на положају С-4 супституисан алкил или арил остатком. Тако су деривати 4-метоксикумарина супституисани у положајима С-5 и С-7 триазил остацима (Слика 9) показали висок ниво антимикробне активности на широк спректар бактерија и гљива у опсегу МIC=2-64 μg/mL [54]. Слика 9. Триазил деривати 4-метоксикумарина са антимикробном активношћу Докторска дисертација-ПРИЛОЗИ Милан Младеновић, Крагујевац, 2011. године 189 Прилог 3. Публиковане референце у којима су објављени резултати докторске дисертације Докторска дисертација-ПРИЛОЗИ Abstract: Several novel 4-hydroxy-chromene-2-one derivatives 2b-16b were easily prepared through condensation reactions with microwave heating and characterized by elemental analysis, IR, 1 H-NMR and mass spectrometry. Geometry optimization of these compounds was executed by PM3, PM5 and Minimize Energy methods to describe them via molecular descriptors. The antimicrobial activity of the synthesized compounds was evaluated against different microbial strains using two different methods: the diffusion method and the micro-dilution method. All data indicated that the products possess antimicrobial activity which depends on the nature of substituent attached to the benzopyran moiety. In general, after 24 h the MIC values of most tested coumarins was 0.13 mg/mL, but compounds 1 and 6b displayed the strongest antimicrobial activity on the tested cultures of bacteria after 48 h. Compound 13b has the strongest growth inhibitory potential on fungus C. albicans, tested by diffusion method, with an inhibition zone of 30-37 mm at a concentration of 150 µg/mL. The conclusion of this experiment is that the synthesized compounds have varied and different influence on different classes of bacteria and the fungus C. albicans. Abstract: This paper presents the design of novel 4-hydroxy-chromene-2 one derivatives, based on previously obtained minimal inhibitory concentration values (MICs), against twenty four microorganism cultures, Gram positive and negative bacteria and fungi. Two of our compounds, 3b (MIC range 130-500 μg/mL) and 9c (31.25-62.5 μg/mL), presented high potential antimicrobial activity. The compound 9c had equal activity to the standard ketoconazole (31.25 μg/mL) against M. mucedo. Enlarged resistance of S. aureus, E. coli and C. albicans on the effect of potential drugs and known toxicity of coumarin antibiotics, motivated us to establish SAR and QSAR models of activity against these cultures and correlate biological activity, molecular descriptors and partial charges of functional groups to explain activity and use for the design of new compounds. The QSAR study presents essential relation of antimicrobial activity and dominant substituents, 4-hydroxy, 3-acetyl and thiazole functional groups, also confirmed through molecular docking. The result was ten new designed compounds with much improved predicted inhibition constants and average biological activity.
doi:10.2298/kg20111228mladenovic fatcat:7ido455v7nb7tm4ypgtm6kgshy