Supercoiled dna as a substrate for detection of endonucleolytic activities in commercial and laboratory biochemical preparations
Выявление эндонуклеазных примесей в коммерческих и лабораторных биохимических препаратах с помощью сверхскрученных ДНК

Yu. F. Drygin, K. L. Zuklys
1986 Biopolymers and Cell  
Введение. При выделении интактных плазмид и фаговых ДНК в сверхскрученной форме и изучении структуры природных нуклеопротеидов возникает необходимость выявления нежелательных примесных эндонуклеаз в используемых ферментативных и химических препаратах. В качестве субстрата для определения неспецифической эндонуклеазной примеси в течение ряда лет мы с успехом используем сверхскрученные бактериальные плазмиды, полученные хлорамфениколзависимой амплификацией, главным образом, плазмиду pBR322. Ранее
more » ... [1-3] было показано, что сверхскрученные ДНК являются субстратом не только для ДНКаз, специфичных в отношении двунитевых ДНК, но и для эндонуклеаз, гидролизующих преимущественно однонитевые нуклеиновые кислоты. Известно также, что при хлорамфеникольном блоке в бактериальных плазмидах -производных плазмиды ColE1 -консервируются полирибонуклеотидные «праймеры» репликации плазмиды [4], и такие плазмиды гидролизуются панкреатической РНКазой. Сверхскрученные ДНК могут быть высокочувствительным репортером активности эндонуклеаз, поскольку разрыв лишь одной фосфодиэфирной связи в сверхскрученной ДНК переводит ее в топологически отличную открытую кольцевую форму. Более глубокий гидролиз приводит к появлению линейной ДНК или ее фрагментов. Как исходная сверхскрученная ДНК, так и продукты ее гидролиза четко разделяются и идентифицируются методом электрофореза ДНК в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Цель настоящей работы -показать, что сверхскрученные ДНК являются универсальным субстратом для обнаружения примесной эндонуклеазной активности в самых разнообразных коммерческих и лабораторных биохимических препаратах, используемых для работы с ДНК и дезоксинуклеопротеидами.
doi:10.7124/bc.0001ca fatcat:5hfos7662zdixfhdcy23tvamsa