Contamination of drinking water with arsenic is a recurring problem in both industrialized and developing countries. Supplies for large populations can have concentrations much higher than the permissible levels, set by the World Health Organization (WHO) to 10 µg As/L for most European countries and the United States and to 50 µg As/L elsewhere. As arsenic analysis requires high-end instruments, which are largely unavailable in developing countries, bioassays based on genetically engineered

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... teria have been proposed as suitable alternatives. Yet, such tests would profit from better standardization and direct incorporation into sensing devices. The final objective of this work was to develop a microfluidic device in which bacterial bioreporters could be embedded, actively maintained for at least one week, exposed to arsenic and which allowed direct detection of the reporter signal produced, as a further step towards a complete miniaturized bacterial biosensor. The signal element in the biosensor is a nonpathogenic laboratory strain of Escherichia coli, which produces a variant of the green fluorescent protein after contact to arsenite and arsenate. To reach the stated objective, we proposed two different solutions. The first one consists in the encapsulation of E. coli bioreporter cells in agarose beads and in their incorporation into a microfluidic device, where they are captured in 500 x 500 µm 2 cage and exposed to aqueous samples containing arsenic. Cells in beads frozen at -20 • C in the microfluidic chip retained inducibility for up to a month and arsenic samples with 10 or 50 µg As/L could be reproducibly discriminated from the blank in less than 200 minutes. In the second approach, we directly captured free cells against a filter wall and for their active maintenance we integrated a microchemostat on chip. Because of a lack of robustness of the microfluidic device, we could not maintain cells on chip for more than one week, but we showed that it is possible to have a biosensor in which the sensitive element is continuously renewed and, when needed, exposed to the target chemical. v Abstract In the last part of this thesis, we studied the relation between arsenite transport and reporter signal production. We observed the formation of extensive gradients of reporter signal intensity as a function of distance to the inflowing sample, arsenite concentration and flow rate, and we attempted to explain their nature by a modeling approach. We think that the devices proposed in this work constitute a crucial step forward in the direction of an inexpensive and robust in-field arsenic detection system. Version abrégée La contamination de l'eau potable par l'arsenic est un problème aussi récurrent dans les pays industrialisés que dans les pays en voie de développement. En effet, les réserves d'eau peuvent contenir des concentrations beaucoup plus grandes que les limites permissibles, qui ont été fixées par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) à 10 µg As/L en Europe et à 50 µg As/L ailleur. Puisque l'analyse de l'arsenic requière des instruments de haute gamme, qui ne sont pas disponibles dans les pays en voie de développement, des solutions alternatives ont été proposées. Une des plus prometteuse utilise des tests biologiques basés sur l'utilisation de bactéries génétiquement modifiées, lesquels bénéficieraient d'une meilleure standardisation et de l'incorporation dans des dispositifs microfluidiques. Dans l'optique de marquer une nouvelle étape vers la conception d'un biocapteur bactérien complètement miniaturisé, l'objectif principal de ce travail était de développer un système microfluidique dans lequel les bactéries sensibles à l'arsenic pourraient être incorporées, maintenues en vie pendant au moins une semaine, exposées à l'arsenic et qui permetterait la détection directe du signal rapporteur produit. L'élément sensible est une souche de laboratoire non-pathogène de Escherichia coli qui, au contact avec l'arsenite et l'arsenate, produit une variante de la protéine GFP. Pour atteindre le but que nous nous étions fixés, nous avons développé deux solutions différentes. La première consiste en l'encapsulation des cellules sensibles dans des billes d'agarose et dans l'incorporation de ces dernières dans un système microlfuidique où elles sont capturées dans une cage de 500 x 500 µm 2 et exposées à l'échantillon aqueux à analyser. En les congélant à -20 • C dans le chip, nous avons réussi à maintenir l'inductibilité des cellules pendant un mois et nous avons pu discriminer des échantillons avec 10 ou 50 µg/L d'arsenic en moins de 200 minutes de manière reproductible. Dans la seconde approche, nous avons directement accumulé les cellules contre un filtre et pour les maintenir en vie dans le système, nous avons intégré un chemostat. À cause d'un manque de vii Version abrégée robustesse du dispositif, nous n'avons pas pu maintenir les cellules sur la puce pendant plus d'une semaine ; néammoins nous avons démontré qu'il est possible d'avoir un biocapteur dans lequel l'élément sensible est continuellement renouvélé et, au moment voulu, exposé à la substance chimique cible. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié la relation entre le transport d'arsenic et la production du signal rapporteur. Nous avons observé que le signal rapporteur produit par les cellules accumulées contre le filtre présente des gradients en fonction de la distance du point où l'échantillon entre en contact avec les cellules, la concentration d'arsenic et le débit, et nous avons réussi à expliquer leur nature grâce à une approche de modélisation. Nous sommes convaincus que les systèmes proposés dans le cadre de ce travail représentent une étape essentielle dans le développement d'un système de détection de l'arsenic bon marché, robuste et utilisable sur le terrain. Mots-clés : biocapteur bactérien, microfluidique, arsenic, Escherichia coli, ArsR, protéine GFP, chemostat sur chip, microfabrication. viii Riassunto La contaminazione dell'acqua potabile da parte dell'arsenico è un problema ricorrente sia nei paesi industrializzati sia in quelli in via di sviluppo. Le riserve idriche possono infatti contenere delle concentrazioni di arsenico sensibilmente superiori alla soglia di tolleranza, fissata dall'Organizzazione mondiale della Sanità a 10 µg As/L in Europa e negli Stati Uniti e a 50 µg As/L nel resto del mondo. Siccome l'analisi dell'arsenico richiede strumenti di alta gamma, i quali non sono disponibili nei paesi in via di sviluppo, sono state proposte diverse soluzioni alternative. Una delle più promettenti è quella delle analisi biologiche basate sull'utilizzo di batteri geneticamente modificati, le quali trarrebbero beneficio da una maggiore standardizzazione e dall'incorporazione in dispositivi microfluidici. Nell'ottica di compiere un primo importate passo vero la concezione di un biosensore batterico completamente miniaturizzato, l'obiettivo principale di questo lavoro era quello di sviluppare un sistema microfluidico nel quale i batteri sensibili all'arsenico avrebbero potuto essere incorporati, mantenuti in vita per almeno una settimana, esposti all'arsenico e che avrebbe permesso il rilevamento diretto del segnale reporter prodotto. Come elemento sensibile abbiamo utilizzato un ceppo di laboratorio non patogeno di Escherichia coli che, a contatto con l'arsenito e l'arsenato, produce una variante della proteina GFP. Per raggiungere l'obiettivo fissato, abbiamo sviluppato due diverse soluzioni. La prima consiste nell'incapsulamento delle cellule sensibili in biglie di agarosio e nell'incorporazione di queste ultime in un sistema microfluidico, dove vengono catturate in una gabbia di 500 x 500 µm 2 ed esposte al campione acquoso da analizzare. Congelando le biglie a -20 • C nel chip siamo riusciti a mantenere l'inducibilità durante un mese e siamo stati in grado di discriminare concentrazioni di 10 e 50 µg/L di arsenico in meno di 200 minuti e in maniera riproducibile. Il secondo approccio consiste nell'accumulare direttamente le singole cellule contro un filtro. Per poterle mantenere in vita abbiamo integrato un chemostato nel chip. Il sistema non ix Riassunto si è rivelato sufficientemente robusto per permetterci di andare oltre una settimana di funzionamento, tuttavia abbiamo mostrato che è possibile realizzare un biosensore nel quale l'elemento sensibile si rinnova continuamente e, quando è necessario, viene esposto alla sostanza chimica da analizzare. Nell'ultima parte di questo lavoro abbiamo analizzato la relazione tra il trasporto dell'arsenico e la produzione del segnale reporter. Abbiamo osservato che il segnale reporter prodotto dalle cellule accumulate contro il filtro presenta dei gradienti in funzione della distanza dal punto in cui il campione entra in contatto con le cellule, la concentrazione di arsenico e la sua portata, e siamo riusciti a spiegare la loro natura grazie a un approccio di modellazione. Siamo convinti che i sistemi proposti in questo lavoro rappresentino una tappa fondamentale per lo sviluppo di un sistema di rilevamento dell'arsenico poco costoso, robusto e utilizzabile sul campo.