Target gene regulation by EBV latent transcription factors - exploiting cellular enhancer elements [thesis]

Laura Viola Glaser
2017
Die latente Epstein-Barr-Virus (EBV) Infektion und die damit einhergehende Expression von EBV Nukleären Antigen (EBNA) Proteinen sind mit verschiedenen B-Zell Tumoren assoziiert. Die Infektion von ruhenden primären B-Zellen in vivo leitet Differenzierungsprogramme ein, die typischerweise mit B-Zellaktivierung und -proliferation korrelieren. Letztendlich entstehen persistierende, nicht proliferierende B-Gedächtniszellen, welche durch die minimale Expression viraler Gene gekennzeichnet sind. In
more » ... zeichnet sind. In vitro wird dieser Prozess in einem proliferativen Stadium blockiert, phänotypisch ähnlich einem B-Zellblasten, und lymphoblastoide Zelllinien (LCLs) entstehen. EBNA2, EBNA3A und EBNA3C (E2, E3A und E3C) fungieren als Transkriptionsfaktoren (TF), die in der Lage sind die Transkription der Wirtszelle zu manipulieren. Des Weiteren sind sie essentiell für die B-Zelltransformation und EBV-getriebene Proliferation. Differenzielle Genexpressionsstudien, unter der Verwendung von Deletionsmutanten oder konditionellen Expressionssystemen, enthüllten teilweise überlappende sowie einzeln regulierte EBNA Zielgene. Um gemeinsame oder unabhängige EBNA Funktionsweisen zu untersuchen, wurden rekombinante EBV Genome und anschließend LCLs hergestellt. Diese wurden zur Identifizierung von EBNA Bindestellen im humanen Genom durch ChIP-seq Methoden verwendet. Die dabei erhobenen Daten wurden mit Informationen zu Chromatinstruktur und TF-Bindestellen aus LCLs, die im Rahmen des ENCODE Projekts publiziert wurden, kombiniert und verglichen. Ein bioinformatischer Ablauf wurde spezifisch für diesen Zweck, unter Verwendung der Galaxy Plattform, entworfen. Dabei konnte gezeigt werden, dass E2 bereits bestehende B-Zellenhancer bindet. Ein neuartiger Ansatz, der eine quantitative Bewertung und den Vergleich von Bindestellen einschließt, konnte die reziproke Besetzung von B-Zellenhancern durch E2 und E3 Proteine zeigen. Diese werden begleitet durch unterschiedliche TF Kombinationen, welche die spezifischen Bindemuster für das jeweilige EBNA Protein definieren. Des Weiteren indiziert die auffallende Korrelation der Besetzung und Anreicherungsmuster von E3A und E3C Bindestellen eine mögliche Kooperation in der gezielten Chromatinbindung. Alle drei EBNA Proteine sind nicht in der Lage DNA direkt zu binden, sondern bedienen sich zellulärer Adapter, wobei CSL/CBF1, das zentrale Effektormolekül des Notch-Signalwegs, den am umfassendsten beschriebenen darstellt. Die Untersuchung von EBNA2 Bindestellen in CSL/CBF1 negativen Burkitt-Lymphom Zelllinien konnte einen massiven Besetzungsverlust aufzeigen und damit CSL/CBF1 als die Haupt-jedoch nicht einzige Determinante für den Zugang von E2 an Chromatin bestätigen. Analysen zur Motifanreicherung und der Vergleich mit ChIP-seq Daten aus LCLs identifizierten den für B-Zellen charakteristischen TF EBF1 als einen wichtigen Faktor für die E2 Bindung. Letztendlich konnte die Interaktion von E2 und EBF1 in B-Zellen gezeigt werden. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis der zellulären Mechanismen bei, die von den EBNA Proteinen instrumentalisiert werden, um selektiv Zielgene der Wirtszelle zu regulieren. Außerdem stellen sie einen Ausgangspunkt für die Identifizierung von deterministischen Voraussetzungen für das selektive Binden von E2, E3A oder E3C an Chromatin dar. Abstract Latent Epstein-Barr virus (EBV) infection and the accompanied expression of EBV Nuclear Antigen (EBNA) proteins are associated with multiple B cell malignancies. Infection of resting primary B cells in vivo triggers differentiation programs typically linked with B cell activation and proliferation. Eventually, persistent non-proliferating memory B cells arise, characterized by minimal expression of viral genes. This process is blocked in vitro at a proliferating state, phenotypically similar to a B cell blast, resulting in lymphoblastoid cell lines (LCLs). EBNA2, EBNA3A, and EBNA3C (E2, E3A, and E3C) operate as transcription factors (TFs) which are able to manipulate host cell transcription and are vital to B cell transformation and EBV driven proliferation. Differential gene expression studies, employing knock-out mutants or conditional expression systems, revealed partially overlapping as well as uniquely regulated EBNA target genes.
doi:10.5282/edoc.22055 fatcat:hh47yhja4zfvzi6qlxkhek4ec4