Detecção e contagem de Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae no leite por PCR em tempo real [thesis]

Aline Gerato Dibbern
DEDICATÓRIA Aos meus pais, Roseli e Osmin, pelo amor, ensinamentos, educação, respeito, companheirismo e preocupação recebidas em todos os momentos dessa longa jornada. A minha irmã, Caroline, pela amizade, risadas, intrigas e conhecimentos compartilhados durante todos os momentos. As minhas tias, Rosangela e Edileni, e as minhas avós, Antônia e Wilma, pelo amor, amizade, companheirismo, ajuda e ensinamentos recebidos, compartilhados e retribuídos durante todos esses anos. O meu Muito
more » ... meu Muito Obrigada!!!!! AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela minha família, pelas oportunidades que me foi cedida, pelos ensinamentos sem respostas e por colocar pessoas incríveis no meu caminho. Agradeço aos meus pais, Osmin Cesar Jacon Dibbern e Roseli Jeronymo Gerato Dibbern, a minha irmã, Caroline Gerato Dibbern, as minhas tias, Edileni Jeronymo Gerato e Rosangela Jeronymo Gerato e as minhas avós, Wilma Jeronymo Gerato e Antônia Maria Jacon Dibbern pelo amor, ensinamentos e princípios de vida construídos. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo pela oportunidade de executar o mestrado. Ao Prof. Marcos Veiga dos Santos, meu orientador, pela oportunidade de elaborar mais um trabalho juntos, pela confiança, ensinamentos, conselhos e amizade. Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado durante todo esse período. À amiga Juliana Regina Barreiro Raspantini (Ju) que esteve sempre presente em todos os momentos do meu mestrado com ensinamentos, palavras amigas, conselhos e risadas. Certamente sua presença foi fundamental para execução e elaboração deste experimento. Muito obrigada por ter estado ao meu lado e espero ter ajudado a expandir seus conhecimentos e contribuído de alguma forma com seu crescimento pessoal e profissional. Ao amigo Bruno Garcia Botaro, que mesmo longe sempre esteve ao meu lado compartilhando seus conhecimentos, sua amizade e seu respeito. À amiga e filha Mariana Pallú Viziak pela amizade, conselhos, risadas e por permitir que eu pudesse compartilhar meus ensinamentos com você. Espero ter contribuído com seu crescimento pessoal e profissional durante meu mestrado e sua iniciação científica. Aos amigos Juliano Leonel Gonçalves, Renata de Freitas leite, Bruna Gomes Alves, Eduardo de Souza Campos Pinheiro e Lorena Borges Ferreira, que sempre auxiliaram na execução do experimento e sempre com palavras amigas, conselhos e risadas. Ao técnico José Franchini Garcia Moreno (Zeca) e a especialista de laboratório Lucinéia Mestieri do Laboratório de Pesquisas em Qualidade do Leite (Qualileite) pela ajuda cedida durante a execução do experimento, pelo aprendizado, amizade e confiança. Aos produtores de leite que cederam seu rebanho leiteiro comercial para amostragem de leite, pela confiança, amizade e companheirismo: Maria Beatriz Dotta (São Carlos/SP), Jairo Halmiton (São Jão da Boa Vista/SP), Senhor Francisco (Aguaí/SP) e ao Professor Francisco Palma Rennó (Pirassununga/SP). Sem a colaboração de vocês nada disso seria possível. Aos amigos do Laboratório Qualileite pelo companheirismo, amizade, paciência e aprendizado: Lúcia e a todos os técnicos de laboratório que de alguma forma auxiliam neste trabalho. Aos meus amigos que residem em Limeira/SP, Pirassununga/SP e São Paulo/SP, que desenvolvem alguma atividade na Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP) e da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ/USP), que de alguma forma auxiliaram no decorrer desta etapa, com palavras de amizades, companheirismo, conselhos e críticas construtivas que possibilitaram meu crescimento pessoal e profissional. Meus sinceros agradecimentos a todos que de alguma forma contribuíram durante todo o período do mestrado. Muito Obrigada!!! EPÍGRAFE "A dúvida é o princípio da sabedoria." Aristóteles "O saber a gente aprende com os mestres e os livros". "A sabedoria se aprende é com a vida e com os humildes." Cora Coralina RESUMO DIBBERN, A. G. Detecção e contagem de Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae no leite por PCR em tempo real. [Detection and enumeration of Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae in milk by Real-Time PCR]. 2015. 109 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) -Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2014. O presente trabalho foi organizado em dois estudos. O objetivo do primeiro estudo foi determinar o efeito da infecção intramamária (IIM) causada por S. aureus e S. agalactiae na contagem de células somáticas (CCS) e na composição do leite (gordura, proteína, lactose, sólidos totais e extrato seco desengordurado), o efeito da contagem de S. aureus e S. agalactiae sobre a composição do leite e a estimativa da frequência de vacas e de quartos infectados com S. aureus e S. agalactiae por meio da contagem do tanque. O objetivo do segundo estudo foi avaliar a reação em cadeia da polimerase em Tempo Real (qPCR) como metodologia alternativa à cultura microbiológica, por meio da sensibilidade diagnóstica, da concordância e da equivalência entre as metodologias para identificação e contagem de S. aureus e S. agalactiae de origem das vacas com IIM. O experimento foi realizado em quatro rebanhos comerciais com histórico de mastite causada por S. aureus e S. agalactiae. Foram coletadas 785 amostras compostas de leite, 3049 amostras de leite de quartos mamários de todas as vacas em lactação e 12 amostras de leite de tanque dos rebanhos selecionados, durante 3 meses consecutivos, totalizando 3 coletas por rebanho. As amostras de leite foram submetidas à detecção e contagem de S. aureus e S. agalactiae por meio de cultura microbiológica e de qPCR, e à análise de composição e CCS. No primeiro estudo, foi observado que amostras compostas de leite com S. agalactiae apresentaram menores teores de lactose e maiores teores de gordura, proteína, sólidos totais e CCS, e com S. aureus apresentaram menores teores de lactose e maiores teores de proteína e de CCS do leite. O aumento da contagem de S. aureus e S. agalactiae em amostras compostas de leite pode ocasionar aumento linear nos teores de lactose e de extrato seco desengordurado. Foi observado que as amostras compostas de leite e de quartos mamários apresentaram relação positiva referente às contagens de S. aureus e S. agalactiae e ao percentual (%) de amostras de leite com S. aureus e S. agalactiae. A partir de amostras compostas de leite pode-se estimar o percentual de quartos mamários com S. aureus e S. agalactiae. A contagem de S. aureus e de S. agalactiae de amostras de leite de tanque pode estimar o percentual de vacas com S. aureus e o percentual de quartos mamários com S. agalactiae. No segundo estudo, foi observado equivalência e concordância de resultados de identificação e contagem de S. agalactiae entre as metodologias de qPCR e cultura microbiológica somente em amostras de leite de tanque e de quartos mamários. Em amostras de leite com S. aureus e S. agalactiae, a qPCR apresentou sensibilidade diagnóstica de 71,54% e 90.20% em amostras de leite de quartos mamários, 71,79% e 87,72% em amostras compostas de leite e 50,00% e 90,91% em amostras de leite de tanque, respectivamente. Portanto, o leite de tanque e a qPCR podem se utilizadas para monitoramento da mastite bovina no rebanho leiteiro. Palavras-chave: Mastite. Leite. Staphylococcus aureus. Streptococcus agalactiae. Cultura microbiológica. Reação em cadeia da polimerase em tempo real. ABSTRACT DIBBERN, A. G. Detection and enumeration of Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae in milk by Real-Time PCR. [Detecção e contagem de Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae no leite por PCR em tempo real]. 2015. 109 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) -Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2014. This work was organized in two studies. The purpose of the first study was to determine the effect of intramammary infection (IMI) caused by S. aureus and S. agalactiae in somatic cell count (SCC) and composition of milk (fat, protein, lactose, total solids and nonfat dry), the effect of S. aureus count and S. agalactiae on milk composition and an estimated frequency of cows and quarters infected with S. aureus and S. agalactiae by counting the tank. The purpose of the second study was to evaluate the polymerase chain reaction in real time (qPCR) as an alternative methodology to microbiological culture, through the diagnostic sensitivity, for consistency and equivalence between the methodologies for identification and enumeration of S. aureus and S. agalactiae source of cows with IMI. The experiment was conducted in four commercial herds with mastitis history caused by S. aureus and S. agalactiae. We collected 785 samples composed of milk, 3049 milk samples from mammary glands of all lactating cows and 12 from the selected herds tank milk samples for 3 consecutive months, totaling 3 samples per herd. The milk samples were subjected to the detection and counting of S. aureus and S. agalactiae through microbial culture and qPCR, and the composition analysis and SCC. In the first study, it was observed that composite milk samples with S. agalactiae had lower lactose content and higher fat content, protein, total solids and SCC, and S. aureus showed lower lactose content and higher protein content and SCC milk. Increased count of S. aureus and S. agalactiae in composite samples of milk can cause a linear increase in the levels of lactose and nonfat dry. It was observed that the composite milk sample and mammary glands were closely related to the counts of S. aureus and S. agalactiae and the percentage (%) of samples of milk with S. aureus and S. agalactiae. From composite samples of milk can estimate the percentage of mammary quarters with S. aureus and S. agalactiae. The count of S. aureus and S. agalactiae of tank milk samples can estimate the percentage of cows with S. aureus and the percentage of mammary quarters with S. agalactiae. In the second study, it was observed equivalence agreement and identification results and S. agalactiae count between the methodologies of qPCR and microbiological culture only in tank milk samples and mammary glands. In milk samples with S. aureus and S. agalactiae, qPCR showed diagnostic sensitivity of 71.54% and 90.20% in milk samples from mammary quarters, 71.79% and 87.72% on composite samples of milk and 50.00% to 90.91% in tank milk samples, respectively. Therefore, the tank and the qPCR milk can be used for monitoring of bovine mastitis in dairy cattle. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the effect of the count of S. aureus and S. agalactiae on milk composition in composite samples and tank, and estimate the frequency of infected cows and rooms with S. aureus and S. agalactiae in the herd by means of counting the tank. Were collected aseptically, four dairy herds of Pirassununga/SP region for three consecutive months, 3049 milk samples from mammary quarters, 785 composite samples of milk and 12 tank milk samples for identification and enumeration of S. aureus and S. agalactiae, and composite milk samples and tank to determine the SCC and composition. Milk samples were collected aseptically analyzed by qPCR for microbiological culture, and counting the S. aureus and S. agalactiae. The SCC of the milk samples was performed by flow cytometry and fat, lactose, protein, and total solids nonfat dry were analyzed by infrared absorption. Cows with isolation of S. agalactiae had lower levels of lactose and higher fat content, protein, total solids and SCC compared to healthy cows. Composite samples of milk with S. aureus had lower lactose levels and higher levels of protein and milk SCC compared to healthy cattle. Increased count of S. aureus and S. agalactiae in composite samples of milk can cause a linear increase in the levels of lactose and solids nonfat. It was observed from the composite milk sample can estimate the number of cows and the percentage of udder quarters with S. aureus and S. agalactiae. Composite samples of milk and mammary quartes were closely related to S. aureus counts and S. agalactiae, and the percentage (%) of milk samples with S. aureus and S. agalactiae. The individual contribution of CFU/mL of S. aureus and S. agalactiae in tank milk samples can estimate the percentage of cows with S. aureus and the percentage of mammary quarters with S. agalactiae. Therefore, from composite samples of milk can be estimated by the number and percentage of udder mammary quarters infected with S. aureus and S. agalactiae, to alter the composition of milk and SCC, and from the count and S. aureus S. agalactiae tank samples can be estimated the percentage of cows with S. aureus and mammary quarters with S. agalactiae.
doi:10.11606/d.10.2016.tde-04082015-111522 fatcat:weabptjo6rhfpedaws3c7z6ava