Acetohydroxyacid synthases (AHAS) sind Enyzme im Aminosäurestoffwechsel von Bakterien, Pflanzen, Pilzen und Archaeen. Durch eine Carboligation von zwei Pyruvatmolekülen zu Acetolactat oder einem Pyruvatmolekül und einem α – Ketobutyratmolekül zu 2-Aceto-2 Hydroxybutyrat leiten sie den Biosyntheseweg der verzweigtkettigen Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin ein. Die Enzyme sind Thiamindiphosphat (ThDP), Flavinadenindinukelotid (FAD) und Mg2+ abhängig. Einzigartig unter den ThDP abhängigen

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... ymen ist, dass sie aus zwei verschiedenen Polypetidketten bestehen, einer mit katalytischer und einer mit regulatorischer Funktion. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei putative AHAS (regulatorische und katalytische Untereinheit) aus Clostridium aceticum und Helicobacter canadensis kloniert, produziert und gereinigt. Mittels Aktivitätsanalyse sollte zudem ihre Annotation als AHAS überprüft werden. Zur Reinigung wurde zunächst an die katalytischen Untereinheiten ein His-Tag, je C- und N-terminal ein His-tag fusioniert. Die regulatorischen Untereinheiten wurden C-terminal mit einem His-tag fusioniert. Dies wurde durch die Klonierung der Gene in verschiedene pET-Vektorsysteme erreicht. Die Produktion wurde in einem Autoinduktionsmedium mit Laktose als Induktor durchgeführt. Die anschließEnde Reinigung erfolgte mittels Ni-NTA- Affinitätschromatographie. Die Aktivität der Enzyme wurde photometrisch durch die physiologische Reaktion der Carboligation zweier Pyruvatmoleküle zu Acetolactat gemessen. Nach der Auswertung zeigte die AHAS aus Clostridium aceticum unter den getesteten Bedingungen keine Aktivität, wohingegen für die Helicobacter canadensis AHAS eine hohe Aktivität nachgewiesen werden konnte. Für dieses Enzym konnte die Annotation somit bestätigt werden.