Gap junctional intercellular communication capacity by gap-FRAP technique: A comparative study

Muriel Abbaci, Muriel Barberi-Heyob, Jean-René Stines, Walter Blondel, Dominique Dumas, François Guillemin, Jacques Didelon
2007 Biotechnology Journal  
THESE Présentée et soutenue publiquement Le 21 Octobre 2008 Pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE HENRI POINCARE -NANCY 1 Discipline : Ingénierie cellulaire et tissulaire Par Muriel ABBACI Suivi de la fonctionnalité des jonctions communicantes par la technique de gap-FRAP sur des modèles in vitro (2-D, 3-D) et ex vivo : Intérêt pour le diagnostic du cancer Gap junctional communication capacity in an orthotopic rat bladder tumor model after intravesical instillation by gap-FRAP
more » ... ue. Soumis 09/08. Abbaci M., Bastogne T., Dumas D., Didelon J., Guillemin F., Blondel W. and Barberi-Heyob M. A system engineering model to analyze gap-FRAP in a multicellular 3-dimensional model. Eur. Biophys. J, en révision. Abbaci M., Barberi-Heyob M., Blondel W.,Guillemin F., Didelon J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Instrumental optimization of Gap-FRAP technique related to gap junctions functionality for different cell types. ITBM-RBM, 26, 279-281, 2005. PRÉSENTATIONS ORALES ET PAR POSTER Gap-FRAP technique applied on spheroid three-dimensional model with the confocal scanning laser microscope. Abbaci M., Barberi-Heyob M., Blondel W., Dumas D, Guillemin F., Didelon J. International Gap Junction conference, Helsingor : Danemark (2007) poster. Application de la technique de gap-FRAP en mode monophoton sur modèle tridimensionnel de sphéroïdes. Abbaci M., Barberi-Heyob M., Blondel W., Guillemin F., Didelon J. 11e Congrès annuel de l'Association Française de Cytométrie, CYTOMETRIE'2006, Bruges : Belgique (2006) communication orale. Application de la technique de gap-Fluorescence Recovery After Photobleaching en mode monophoton sur modèle tridimensionnel de sphéroïdes. Abbaci M., Barberi-Heyob M., Blondel W., Guillemin F., Didelon J. Journée Annuelle de la Recherche Médicale de la faculté de médecine de Nancy, Nancy : France (2006) et Journée de Rencontres Club SFO (Société Française d'Optique) Photonique et Sciences du Vivant (PSV), Paris : France (2006) poster. tel-00343150, version 1 -29 Nov 2008 In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Résumé Ce travail de recherche s'inscrit dans un axe de diagnostic du cancer via le développement d'une méthode optique pour la caractérisation fonctionnelle de tissus. La technique de gap-FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) permet l'étude quantitative de la fonctionnalité des jonctions gap. La majorité des cellules néoplasiques se caractérisent par une modification du niveau d'expression et/ou de la fonctionnalité des jonctions gap par comparaison à leurs homologues saines. La technique de gap-FRAP permet en conséquence de discriminer les cellules cancéreuses en fonction de la communication intercellulaire gap jonctionnelle (CIGJ). Particulièrement utilisée in vitro, cette technique restait cependant anecdotique ex vivo. Nous avons validé la faisabilité du transfert de cette méthode sur tissus et organes ex vivo. A partir de cellules de statuts différents en expression et en distribution des connexines, nous avons caractérisé la calcéine-AM comme étant une sonde fluorescente adaptée pour des mesures sur tissus. Puis nous avons développé un modèle d'ingénierie systéme pour l'analyse comparative des données de recouvrement de fluorescence sur des modèles bi et tridimensionnels. Nous avons transposé ces conditions préalablement définies sur organe entier ex vivo : la vessie de rat. Un marquage multiple a été optimisé avec une sonde fluorescente pour le tracking des cellules cancéreuses dans la vessie ex vivo, un marqueur pour l'identification histologique de l'urothélium et la calcéine-AM pour mesurer la CIGJ. Le gap-FRAP a été utilisé pour la première fois pour différencier le degré de communication intercellulaire gap jonctionnelle entre le tissu sain et néoplasique sur un organe entier ex vivo, ouvrant des perspectives pour le diagnostic du cancer de la vessie corrélé à la modification de la CIGJ. Abstract Assessing gap junctions functionality using gap-FRAP technique on models in vitro (2-D, 3-D) and ex vivo : Interest for cancer diagnosis Optical methods to characterize tissues for tumor detection are an area of diagnosis research. Gap-FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) technique is used to estimate gap junctions functionality. The majority of malignant cells are characterized by a modification of the number and functionality of gap junctions, compared to their healthy counterparts. Gap-FRAP technique appears adapted to distinguish cancerous cells from normal cells according to their intercellular communication (GJIC). Particularly used in vitro, we optimized the use of gap-FRAP technique for a potential transfer on tissues and organs ex vivo. We resolved, using cell lines with a different connexin expression and distribution pattern, the choice of a fluorescent dye for further in vivo measurements: calcein-AM. The following stage consisted in developing a system engineering model for the comparative analysis of the fluorescence recovery data for bi-dimensional and three-dimensional (spheroid) models. The conditions previously defined have been transposed in entire organ, bladder rat. Multi-color staining was applied using a fluorescent dye to track to tumors cells in bladder ex vivo, a fluorescent marker to distinguish cellular details of the entire urothelium, and calcein-AM to assess GJIC. Gap-FRAP was used for the first time to differentiate intercellular communication degree between healthy and tumor tissue in entire organ ex vivo opening perspectives for the diagnosis of the bladder cancer correlated to feature modifications of GJIC.
doi:10.1002/biot.200600092 pmid:17225250 fatcat:efenxgxlrngyvmcwgttjfc4mr4