Παραγωγή µυελοκατασταλτικών κυτταροκινών στην απλαστική αναιµία 36 3. Απόπτωση 38 3.1 Φυσιολογικός ρόλος του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου 38 3.2 Κύρια γνωρίσµατα της απόπτωσης 40 3.3 Γονίδια και απόπτωση 42 3.3.1 Κασπάσες: οι εκτελεστές των τελικών σταδίων της απόπτωσης 42 3.3.2 Επαγωγή της απόπτωσης από το σύστηµα perforin/granzyme 48 3.3.3 H p53 πρωτεϊνη 48 SUMMARY 146 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σχέσεων των αιµοποιητικών κυττάρων µε το HSC, σήµερα γνωρίζουµε ότι δεν είναι το πλέον αρχέγονο αιµοποιητικό

more »

... κύτταρο. Η τρέχουσα υπόθεση για το HSC είναι ότι µπορεί να αποκαταστήσει πλήρως λεµφοαιµοποίηση και σαν τέτοια κύτταρα θεωρούµε από τις µεν µακράς διάρκειας καλλιέργειες τα LTC-IC (Long Term Culture-Initiating Cells) και CAFC (Cobblestone Area Forming Cells) και από τα πειράµατα επαναπληθυσµοποίησης τα SRC (SCID Repopulating Cells). Ο αριθµός των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων πιστεύουµε ότι διατηρείται σταθερός µέσω της «ασύµµετρης διαίρεσης» κατά την οποία παράγεται ένα κύτταρο µε εντελώς πανοµοιότυπα χαρακτηριστικά και ένα δεύτερο κύτταρο κατά ένα «σκαλί» ωριµότερο. Παρατηρείται επίσης, ότι άλλα προγονικά κύτταρα (progenitors) είναι πολυδύναµα (multi-lineage) και µπορούν να δώσουν απογόνους που να ανήκουν σε περισσότερες από µία κυτταρικές σειρές και άλλα είναι µονοδύναµα (uni-lineage), τα οποία είναι δεσµευµένα (committed) και αποτελούν την απαρχή µιας µόνο κυτταρικής σειράς. Η «δεξαµενή» των stem cells αν και µικρή (1 πολυδύναµο κύτταρο / 10 4 -10 6 κύτταρα µυελού και συνολικά 1-2x10 6 / άτοµο) έχει τεράστιες δυνατότητες. Έτσι αν και λιγότερο από το 5% των stem cells είναι εν ενεργεία, παράγουν περισσότερα από 10 11 κύτταρα αίµατος / ηµέρα. Το υπόλοιπο 95% βρίσκεται στη φάση Go, δηλαδή σε ηρεµία. Το ποιον απόγονο θα δώσουν κάθε φορά τα stem cells εξαρτάται από τα διάφορα ερεθίσµατα, δηλαδή από τους αυξητικούς αιµοποιητικούς παράγοντες. Το ιεραρχικό (stem cell) µοντέλο της αιµοποίησης απεικονίζεται ως εξής (εικόνα 1): Stem cells Progenitor cells Precursor cells Mature cells Self renewal πολλαπλασιασµός Stem cells Progenitor cells Precursor cells Mature cells Self renewal πολλαπλασιασµός Εικόνα 1 1.2.1 Μακράς διάρκειας καλλιέργειες αιµοποιητικών κυττάρων (LTCs) 1.2.1.1 Γενικά χαρακτηριστικά Οι καλλιέργειες µακράς διάρκειας µυελού των οστών (LTBMC-Long Term Bone Marrow Cultures ή LTC) αναπτύχθηκαν για πρώτη πριν 28 χρόνια (Dexter et al., 1977), από κύτταρα µυελού των οστών ποντικού. Λίγο αργότερα η µέθοδος αυτή τροποποιήθηκε και εφαρµόστηκε και σε κύτταρα ανθρώπινου µυελού ( Gartner S., Kaplan HS, 1980). Παρά την ποικιλία άλλων µεθόδων που έχουν αναπτυχθεί για την ανάλυση του αιµοποιητικού ιστού, in vitro, οι LTCs αποτελούν το µοναδικό σύστηµα που επιτρέπει τη διατήρηση της ισορροπίας µεταξύ της ικανότητας αυτοαναπαραγωγής και διαφοροποίησης των αιµοποιητικών κυττάρων µε χαρακτηριστικά των stem cells καθώς και την παραγωγή κυττάρων της µυελικής σειράς όλων των σταδίων ανάπτυξης, για χρονικό διάστηµα µέχρι και 20 εβδοµάδες, χωρίς την προσθήκη αυξητικών παραγόντων. Η διατήρηση των άωρων αιµοποιητικών κυττάρων επιτυγχάνεται µέσω αλληλεπίδρασης αυτών µε τα προσκολληµένα κύτταρα-µυελικής προέλευσης, τα οποία σχηµατίζουν ένα σύνθετο στρώµα, κατά τη διάρκεια των πρώτων εβδοµάδων της καλλιέργειας. Απουσία του στρώµατος, η αιµοποίηση περιορίζεται σηµαντικά και τα κύτταρα που ανήκουν σε πιο άωρες βαθµίδες «εξαντλούνται» προοδευτικά. Ένα βασικό πλεονέκτηµα των LTCs είναι η «αντιγραφή» in vitro των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων µεταξύ αιµοποιητικών και κυττάρων του στρώµατος του µυελού που λαµβάνουν χώρα in vivo. Οι LTCs αποτελούν, σήµερα, ένα πολύτιµο εργαλείο για: 1) την ανάλυση της σχέσης µεταξύ αιµοποιητικών και κυττάρων του στρώµατος του µυελού µέσω µικροσκοπίας, ανοσοϊστοχηµείας και βιοχηµείας, 2) την ανάλυση της παραγωγής και του ρόλου των αυξητικώνευοδωτικών και ανασταλτικών παραγόντων στη ρύθµιση της αιµοποίησης, 3) το χαρακτηρισµό των εξωκυττάριων συστατικών της θεµέλιας ουσίας και τη λειτουργία αυτών στην διαδικασία της αιµοποίησης, 4) τη µελέτη της λευχαιµονογένεσης, 5) τον προσδιορισµό των απαιτήσεων των φυσιολογικών και λευχαιµικών κυττάρων στην ανάπτυξη τους και των αλλαγών στη λειτουργία των κυττάρων του στρώµατος, 6) την ανάπτυξη αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων ως στόχων για «γονιδιακή θεραπεία» και 7) την δηµιουργία ποικίλων αθάνατων κυτταρικών σειρών. Ένα, επίσης, βασικό χαρακτηριστικό των LTCs είναι ότι τα δεσµευµένα προγονικά κύτταρα ωριµάζουν πλήρως και αποµακρύνονται από την καλλιέργεια µέσα στις πρώτες 4 εβδοµάδες. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα τα κλωνογόνα κύτταρα που ανιχνεύονται αργότερα στην καλλιέργεια να αντιπροσωπεύουν απογόνους πιο αρχέγονων κυττάρων και αποκαλούνται «εναρκτήρια κύτταρα καλλιέργειας µακράς διάρκειας» (LTC-IC, Long Term Culture-Initiating Cells) (Van der Sluijs et al., 1990; Winton and Colenda, 1987; Sutherland et al., 1989). Aν η δηµιουργία του στρώµατος των ινοβλαστών στην καλλιέργεια δεν είναι περιοριστική, τότε ο συνολικός αριθµός των κλωνογόνων κυττάρων BFU-e, CFU-GM και CFU-GEMM (αναλύονται παρακάτω) που ανιχνεύονται µετά το πέρας των 4-8 εβδοµάδων καλλιέργειας, µπορεί να συσχετιστεί γραµµικώς µε τον αριθµό των LTC-IC στο αρχικό εναρκτήριο εναιώρηµα κυττάρων της LTC (stem cell ποσοτικοποίηση) (Sutherland et al., 1990). Ανάπτυξη του LTC συστήµατος στο εργαστήριο Απαραίτητες προϋποθέσεις για την εγκατάσταση µιας επιτυχούς καλλιέργειας µακράς διάρκειας είναι: α) η ανάπτυξη του υποστηρικτικού στρώµατος κυττάρων (feeder layer), β) η πηγή των αιµοποιητικών κυττάρων στα οποία εµπεριέχονται και τα LTC-IC, γ) το κατάλληλο θρεπτικό υλικό και δ) ο απαραίτητος εργαστηριακός εξοπλισµός. ♦ Σχηµατισµός στρώµατος Τα προσκολληµένα στρωµατικά κύτταρα που αναπτύσσονται στις LTCs προέρχονται από µη-αιµοποιητικά προγονικά κύτταρα του µυελού των οστών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα, οι ινοβλάστες, τα λιποκύτταρα και τα λεία µυϊκά κύτταρα (Dexter et al., τη χρήση του ακτινοβολείται, ώστε να κατασταλεί η ενδογενής αιµοποίηση (Εaves et al., 1986). Εναλλακτικά, για τον ίδιο σκοπό µπορεί να χρησιµοποιηθούν και έτοιµες στρωµατικές κυτταρικές σειρές (M210B4, SI/SI, MS-5, AFT204 κ.λ.π). Στην προσπάθεια ανάπτυξης του µοντέλου µυελικής απλασίας, στα πλαίσια της διατριβής, χρησιµοποιήθηκε και προεγκατεστηµένο στρώµα ποντικού (Μ210B4 και SI/SI κυτταρικές σειρές), γι'αυτό και παραθέτουµε κάποια στοιχεία αυτών. Τα M210B4 κύτταρα είναι κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού τα οποία, όπως άλλωστε και τα γενετικά τροποποιηµένα, για παραγωγή ανθρώπινης IL-3, G-CSF ή GM-CSF, είδη αυτών, µπορούν να στηρίξουν την ανθρώπινη αιµοποίηση για πάνω από 5 εβδοµάδες (Sutherland HJ et al., 1991b) . Πιο αποδοτική (όσον αφορά την αύξηση των LTC-IC παραγόµενων CFC αποικιών) έχει αποδειχθεί η χρησιµοποίηση µικτού στρώµατος δύο διαφορετικών σειρών ινοβλαστών ποντικού, γενετικά τροποποιηµένων για την παραγωγή ανθρώπινων IL-3, G-CSF και Steel Factor, των M210B4 και SI/SI (Hogge D et al., 1996 , Ailles LE et al., 1997 . ♦ Ο ρόλος του στρώµατος Η στενή, κύτταρο µε κύτταρο, επαφή έδειξε αρχικά ότι είναι απαραίτητη για την επιτυχή υποστήριξη των αρχέγονων κυττάρων από το στρωµατικό µικροπεριβάλλον (Bentley, 1981) , αν και µεταγενέστερες µελέτες προτείνουν ότι κάτι τέτοιο µπορεί να µην είναι και τόσο ουσιώδες (Miller et al., 1992) . Όπως αναφέρθηκε εκτενώς στην εισαγωγή η παραγωγή ευοδωτικών και ανασταλτικών παραγόντων από τα κύτταρα του στρώµατος, διασφαλίζει την ισορροπία µεταξύ πολλαπλασιασµού, διαφοροποίησης και κυτταρικού θανάτου των αρχέγονων κυττάρων. Στις αιµοποιητικά ενεργές LTCs, τα ώριµα προγονικά κύτταρα παραµένουν σε µία διαρκή φάση πολλαπλασιασµού, ενώ τα αρχέγονα κύτταρα (µε υψηλό δυναµικό πολλαπλασιασµού) που φωλιάζουν στο στρώµα πρέπει να διεγερθούν για να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται. Αυτό επιτυγχάνεται όταν φρέσκο θρεπτικό υλικό ή εξωγενείς παράγοντες (όπως IL-1β, PDGF) προστίθενται στην καλλιέργεια. Βέβαια η διέγερση είναι παροδική και µέσα σε µία εβδοµάδα τα προγονικά κλωνογόνα κύτταρα εισέρχονται και πάλι σε φάση ηρεµίας (Cashman et al., 1985) . Η διέγερση µε κυτοκίνες προκαλεί, επίσης, αύξηση των επιπέδων mRNA µιας ποικιλίας αυξητικών παραγόντων στα κύτταρα του στρώµατος, συµπεριλαµβανοµένων των G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte, macrophage CSF), IL-1 και IL-6. Αυτό σηµαίνει ότι η αυξηµένη παραγωγή αυτών (και/ή άλλων) αιµοποιητικών αυξητικών παραγόντων εµπλέκεται στην διέγερση του κυτταρικού κύκλου των αρχέγονων κυττάρων (Eaves et al., 1991b) . Aν, αντίθετα, δεν επιδράσουµε στο στρώµα είτε µε επανατροφοδότηση θρεπτικού υλικού είτε µε παράγοντες, τότε αυτό παρέχει στην καλλιέργεια ανασταλτικούς παράγοντες που δρουν επιλεκτικά στα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα (Cashman J et al., 1990 , Eaves CJ et al., 1991b . Ποσοτικοποίηση των HSCs Οι απόλυτοι αριθµοί των LTC-IC µπορεί να προσδιοριστούν µε την µέθοδο των «διαδοχικών αραιώσεων» (LDA -Limiting Dilution Analysis). Η αρχή της τεχνικής βασίζεται στην υπόθεση ότι υπάρχουν δύο τύποι κυτταρικών πληθυσµών σε ένα κυτταρικό εναιώρηµα, αυτός που µπορεί να παράγει ένα συγκεκριµένο αποτέλεσµα και αυτός που δε µπορεί. Έτσι αναπτύσσοντας χρησιµοποιηθεί, σηµατοδοτεί και την κατεύθυνση διαφοροποίησης αυτών προς ουδετερόφιλα, µακροφάγα ή και τα δύο (Metcalf D, 1991; Metcalf D, 1995) . Οι αποικίες των ουδετεροφίλων και µακροφάγων παρουσιάζουν µία, σχετικά, οµογενή µορφολογία µε έναν αρκετά συµπυκνωµένο πυρήνα κυττάρων περιτριγυρισµένο από µία λιγότερη πυκνή περιοχή (halo) κυττάρων. Τα ουδετερόφιλα είναι µικρά κύτταρα, ενώ τα µακροφάγα αρκετά µεγαλύτερα. Αποικίες βασεοφίλων σπάνια ανιχνεύονται στις συνηθισµένες STC. Αντίθετα, αποικίες ηωσινοφίλων είναι πιο συνήθεις ειδικά σε καλλιέργειες προγονικών κυττάρων περιφερικού αίµατος. Oι προαναφερθέντες τύποι αποικιών απεικονίζονται στην εικόνα 5: CFU-M CFU-G CFU-GM (µικρή) CFU-GM (µεσαία) Εικόνα 5 ♦ Πολυδύναµες αποικίες Τα προγονικά κύτταρα τα οποία µπορούν να δώσουν γένεση σε αποικίες που περιέχουν κύτταρα που ανήκουν σε περισσότερες από µία αιµοποιητικές σειρές, χαρακτηρίζονται ως CFU-GEMM (colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte) (Fauser AA et al, 1978). Οι αποικίες των CFU-GEMM είναι µεγάλου µεγέθους, γεγονός που αποδεικνύει την µεγάλη αναγεννητική τους ικανότητα και συνεπώς αωρότητα τους. Αξιολογούνται µετά τη 14-16 η ηµέρα της καλλιέργειας. Η διέγερση των CFU-GEMM για ανάπτυξη των αποικιών τους απαιτεί Parvo-ιοί: συνδέεται κυρίως µε εµφάνιση αµιγούς απλασίας της ερυθράς σειράς. Το γενετικό υλικό των ιών αντιγράφεται µέσα στα ερυθροποιητικά κύτταρα (CFU-E και ερυθροβλάστες), αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και να προκαλούν κυτταρική λύση (άµεση κυτταροτοξικότητα)(Young N, Mortimer PP Young N, 1988) . Εpstein-Barr Virus (και ίσως και άλλοι ερπητοιοί): ο ιός εισέρχεται στα κύτταρα, δεν τα καταστρέφει αλλά αντιγόνα του εκφράζονται στην επιφάνεια τους µε αποτέλεσµα να αναπτύσσεται ανοσολογική αντίδραση από κυτταροτοξικά κύτταρα, η οποία είτε καταστέλλει, είτε καταστρέφει τα αιµοποιητικά κύτταρα. Αφορά κυρίως προγονικά κύτταρα του µυελού (Baranski B et al, 1988) . Φλαβοϊοί και ηπατίτιδα: οι φλαβοϊοί σχετίζονται µε τον δάγγειο πυρετό που έχει πλέον εκλείψει. Μπορούν και πολλαπλασιάζονται ικανοποιητικά σε ανθρώπινες καλλιέργειες µυελού των οστών PM, Reid D, Gerhard B, Eaves CJ. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.