The ubiquitin E3 ligase Rtt101 affects the replication stress response and replicative senescence through Mrc1/Claspin [article]

Lisa Kastner
2016
The budding yeast protein Rtt101 serves as a scaffold for the assembly of a variety of ubiquitin E3 ligase complexes. Both Rtt101 and its human counterpart CUL4 have been implicated in the maintenance of genomic integrity. In the absence of RTT101, cells are highly sensitive to the genotoxic agents MMS and CPT, which cause DNA damage that results in replication fork stalling in the ensuing S-phase of the cell cycle. The established roles and substrates of Rtt101 can only partially explain the
more » ... riking drug sensitivity. In a genetic screen using Saccharomyces cerevisiae as a model organism we identified Mrc1 as a key suppressor of rtt101 drug sensitivity. Amongst others, Mrc1 contributes to the activation of the intra S-phase checkpoint in response to replicative stress and couples the DNA helicase to the leading strand DNA polymerase ԑ. The rescue of rtt101 cells by MRC1 deletion depended on the presence of the Rad52 protein, the central player of the budding yeast homologous recombination machinery. By employing separation of function alleles we determined that the loss of Mrc1's checkpoint function was not sufficient to alleviate rtt101 drug sensitivity. Instead, the replicative function of Mrc1 seemed to be toxic for rtt101 cells. Our data suggested that Rtt101 does not target Mrc1 for proteolysis. We propose that the ubiquitination of Mrc1 (or an unknown factor regulating Mrc1) by Rtt101 modulates the replisome at the stalled fork, possibly inducing the uncoupling of the helicase from the polymerase. This could allow the production of ssDNA that might trigger replication fork repair or restart by a homologous recombination-based pathway. Telomeres, particularly short telomeres, are difficult to replicate regions of the genome. Telomere shortening during replicative senescence is a natural process in human somatic cells that can be mimicked in budding yeast by deletion of the catalytic subunit of telomerase, Est2. Rtt101 had been reported to prevent premature senescence. Our experiments showed that Rtt101 does not exert its protective function by influencing telomere length. Nor did the accumulation of spontaneous DNA damage that has been reported for rtt101 cells contribute to the acceleration of senescence. Deletion of RTT101 further compromised the viability of senescing rad52 est2 cells suggesting that the crucial action of Rtt101 at shortening telomeres does not involve a homologous recombination event. Surprisingly, mrc1 est2 cells also senesced fast 6 Summary and were epistatic with rtt101 est2 cells. This indicates that during senescence Rtt101 and Mrc1 protect shortening telomeres through a common mechanism. This is in contrast to the situation at stalled replication forks after treatment with MMS or CPT. We speculate that Rtt101 and Mrc1 act in concert to prevent precocious senescence signalling by delaying the creation of subtelomeric ssDNA. Taken together, our results provide insights into how the Rtt101, and perhaps human CUL4, E3 ligase functions to promote genome stability in the face of replication stress and telomere shortening. 7 Zusammenfassung Zusammenfassung Das Protein der Bäckerhefe Rtt101 dient als Gerüst für den Aufbau verschiedener Ubiquitin-E3-Ligase-Komplexe. Rtt101 und CUL4, sein Gegenstück in menschlichen Zellen, tragen zum Erhalt der Unversehrtheit des Genoms bei. In Abwesenheit von Rtt101 reagieren Zellen hochempfindlich auf die genotoxischen Substanzen MMS und CPT. Diese verursachen DNA-Schäden, die in der darauffolgenden S-Phase die Replikationsgabel zum Stillstand bringen. Die bekannten Funktionen und Substrate der Rtt101-basierten Ubiquitin-E3-Ligase-Komplexe können die auffällige Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Substanzen nur teilweise erklären. In einem genetischen Screen mit dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae identifizierten wir Mrc1 als entscheidenden Faktor für die Unterdrückung der Empfindlichkeit von rtt101-Zellen. Mrc1 trägt unter anderem zur Aktivierung des Intra-S-Phase-Checkpoints als Reaktion auf Replikationsstress bei und koppelt die DNA-Helikase an die den Leitstrang synthetisierende Polymerase ԑ. Für die Rettung der rtt101-Zellen durch die Deletion von MRC1 war das Protein Rad52 nötig, das ein zentraler Bestandteil der homologen Rekombinationsmaschinerie ist. Mithilfe von funktionsspezifischen Allelen konnten wir zeigen, dass der Verlust von Mrc1's Checkpoint-Funktion nicht ausreichend war, um die Empfindlichkeit von rtt101-Zellen zu mindern. Stattdessen schien die Replikationsfunktion von Mrc1 für rtt101-Zellen schädlich zu sein. Unsere Daten legten nahe, dass Rtt101 nicht zur Proteolyse von Mrc1 beiträgt. Wir schlagen vor, dass die Ubiquitinierung von Mrc1 (oder eines noch unbekannten, Mrc1 regulierenden Faktors) durch Rtt101 das Replisom an der blockierten Replikationsgabel moduliert und möglicherweise die Helikase von der Polymerase entkoppelt. Dies würde zur Produktion einzelsträngiger DNA führen, was wiederum die Reparatur oder den Neustart der Replikationsgabel durch homologe Rekombination einleiten könnte. Telomere, insbesondere kurze Telomere, lassen sich nur schwer replizieren. Die Verkürzung der Telomere während der replikativen Seneszenz ist ein natürlicher Prozess in somatischen, menschlichen Zellen, der in Bäckerhefe durch die Deletion der katalytischen Untereinheit der Telomerase, Est2, imitiert werden kann. Es war bekannt, dass Rtt101 vorzeitige Seneszenz verhindert. Unsere Experimente zeigten, dass Rtt101 seine Schutzfunktion nicht durch Beeinflussung der Telomerlänge ausübt. Auch die Häufung spontaner DNA-Schäden, die in rtt101-8 Zusammenfassung Zellen stattfindet, beschleunigt die Seneszenz nicht. Die Deletion von RTT101 setzte die Lebensfähigkeit von seneszenten rad52 est2-Zellen weiter herab. Dies impliziert, dass die Funktion von Rtt101 an sich verkürzenden Telomeren nicht auf homologer Rekombination beruht. Überraschenderweise wurden auch mrc1 est2-Zellen vorzeitig seneszent und waren epistatisch mit rtt101 est2-Zellen. Dies zeigt an, dass Rtt101 und Mrc1 sich verkürzende Telomere seneszenter Zellen durch einen gemeinsamen Mechanismus schützen. Dies unterscheidet sich von der Situation an blockierten Replikationsgabeln nach der Behandlung mit MMS oder CPT. Wir spekulieren, dass Rtt101 und Mrc1 zusammenarbeiten, um die vorzeitige Signalisierung von Seneszenz zu verhindern, indem sie die Entstehung von subtelomerischer, einzelsträngiger DNA verzögern.
doi:10.11588/heidok.00021406 fatcat:5svj6blw3vfijotfpe4ils32tu