Hledání vhodných molekulárních markerů pro rozlišení různých druhů enterokoků

Šárka Bobková, Dana Baudišová
2021 Vodohospodářské technicko-ekonomické informace  
Klíčová slova: Enterococcus -fekální znečištění -molekulární markery -trasování původu mikroorganismů (MST) SOUHRN Enterokoky patří spolu se zástupci druhu Escherichia coli mezi tzv. indikátory fekálního znečištění, které se používají při hodnocení mikrobiologické kvality koupacích vod. Jejich stanovení se řídí vyhláškou MZ ČR č. 238/2011 Sb. a provádí se kultivačně na selektivních agarových médiích. Je známo, že ne všechny druhy enterokoků jsou fekálního původu a mají tedy přímou souvislost s
more » ... ekálním znečištěním vody. Pro správné hodnocení kvality koupací vody by bylo vhodné znát i původ těchto bakterií. K trasování původu mikroorganismů (tzv. MST, "microbial source tracking") se s výhodou používá metod molekulární biologie. Pomocí PCR metody lze amplifi kací molekulárních markerů (tj. specifi ckých úseků DNA) odlišit různé druhy enterokoků. Publikací zabývající se touto tématikou je mnoho, nicméně ve většině studií se k druhovému rozlišení používá pouze jeden marker, a to při práci s přírodními vzorky nemusí být vždy dostatečné. Pro spolehlivou druhovou identifi kaci u přírodních vzorků by bylo výhodnější použít kombinaci několika markerů. Zároveň by bylo vhodné aplikovat poznatky získané z experimentů s čistými kulturami na přírodní vzorky koupacích vod, a to jak čistých, tak fekálně znečištěných. Pro praxi by byly důležité i postupy umožňující PCR ze směsného přírodního vzorku, tedy bez nutnosti předkultivace na selektivních médiích, aby se maximálně zkrátila doba, za kterou je znám výsledek. Cílem tohoto příspěvku je přehledně shrnout publikované molekulární markery pro identifi kaci jak enterokoků, tak příbuzných mikroorganismů, a zhodnotit jejich možné použití v mikrobiologii vody pro rychlé zařazení zástupců rodu Enterococcus do druhů při analýze přírodních vzorků. CHARAKTERISTICKÉ ZNAKY ENTEROKOKŮ Enterokoky jsou gram pozitivní, kataláza negativní koky uspořádané obvykle do krátkých řetízků. Jsou to chemoorganotrofové, jejichž hlavním koncovým produktem při fermentaci cukrů je kyselina mléčná. Ačkoliv fenotypické a biochemické odlišení enterokoků od ostatních bakteriálních druhů je složité, mezi hlavní znaky tohoto rodu patří přítomnost D antigenu, tolerance k vyšším teplotám (až 45 °C) i schopnost růstu v přítomnosti 6,5% NaCl. Při jejich identifi kaci v laboratoři se používají selektivní média, na kterých jsou eliminovány ostatní bakteriální druhy (např. SB médium obsahující azid sodný pro potlačení G-tyček). Taxonomicky patří mezi Enterococcacae a v současné době zahrnuje tento rod 43 druhů [1]. Typickým zástupcem je E. faecalis. Enterokoky se přirozeně vyskytují v trávicím traktu teplokrevných živočichů včetně člověka i v trávicím traktu některých bezobratlých (korýši, šneci) [2, 3] a byly izolovány i z povrchových sladkých i slaných vod, z půdy či z rostlinné vegetace. Některé druhy (např. E. faecalis, E. faecium) jsou podmíněně patogenní. Přítomnost enterokoků ve vodě může mít různý původ: buď jsou přirozenou součástí vodního ekosystému a vyskytují se tam volně, nebo mohou být asociovány s rostlinnou vegetací (typicky E. mundtii, E. casselifl avus) [4, 5], nebo se zooplanktonem [6], případně se mohou do vody dostat z půdy [7]. Dalším zdrojem mohou být odpadní vody či exkrementy živočichů, a to jak obratlovců, tak bezobratlých. Za typické intestinální druhy jsou považovány E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae [8]. Jak je z výše uvedeného výčtu patrné, ke správné interpretaci zvýšené hladiny enterokoků ve vodním prostředí by bylo vhodné znát jejich původ. Metody, které se používají k vystopování původu určitých organismů v prostředí, se souhrnně nazývají "microbial source tracking" (MST). Principem těchto metod je, že určité druhy bakterií jsou asociovány s určitými hostiteli či prostředím. U enterokoků jsou např. druhy E. faecalis, E. faecium považovány za typické intestinální druhy (ačkoliv byly izolovány i z jiných ekosystémů) a naopak E. mundtii, E. casselifl avus jsou většinou spojeny s rostlinami [9, 10] . Jednou z metod MST je PCR amplifi kace určitých (defi novaných) úseků DNA (tzv. molekulárních markerů), na jejichž základě je možné rozlišit enterokoky do jednotlivých druhů. V tomto směru existuje značné množství literatury týkající se nejen enterokoků, ale i jiných rodů bakterií, a je možné z toho při hledání vhodných molekulárních markerů vycházet. MOLEKULÁRNÍ MARKERY PRO MST Obecná charakteristika molekulárních markerů Vhodný molekulární marker pro druhové rozlišení bakterií by měl splňovat několik kritérií: 1. měl by být široce rozšířen v genomech bakterií, tj. ve většině bakterií by měl mít ortologní gen, 2. na druhou stranu také musí obsahovat úseky unikátní pro daný druh bez možných paralogních genů, 3. jejich velikosti musí být dostatečné pro možná porovnávání, ale zároveň ne příliš dlouhé, aby se daly celé sekvenovat, 4. sekvence musí být dostatečně reprezentativní, aby postihla spolehlivě charakteristiku genomu daného druhu.
doi:10.46555/vtei.2020.12.005 fatcat:wmgeujzv2zex3p4kgt3l62w5zy