Estudos da inflamação e dor articulares em ratos e dos mecanismos da produção de TNF-a por macrófagos isolados, induzidos pela BaP1, uma metaloproteínase isolada do veneno da serpente Bothrops asper [thesis]

Cristina Maria Fernandes
Estudos da inflamação e dor articulares em ratos e dos mecanismos da produção de TNF-α por macrófagos isolados, induzidos pela BaP1, uma metaloproteinase isolada do veneno da serpente Bothrops asper Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Farmacologia Orientador: Dra. Catarina de Fátima Pereira Teixeira São Paulo 2008 RESUMO FERNANDES, C.M. Estudos da inflamação e dor articulares em
more » ... or articulares em ratos e dos mecanismos da produção de TNF-α por macrófagos isolados, induzidos pela BaP1, uma metaloproteinase isolada do veneno da serpente Bothrops asper. 2008. 117f. Tese (Doutorado em Farmacologia) -Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. As metaloproteinases são enzimas abundantes em venenos de serpentes das famílias Viperidae e Crotalidae e contribuem para as ações dos mesmos por suas ações fibrinolítica, prócoagulante, mionecrótica, hemorrágica e inflamatória. Estas enzimas apresentam alta homologia com as metaloproteinases de mamíferos (MMPs), cujos níveis estão elevados em diversas patologias de natureza inflamatória, como a artrite reumatóide (AR). A AR afeta cerca de 1% da população mundial e causa perdas sócio-econômicas graves. A limitação dos movimentos, secundária à dor articular, é uma característica desse processo e acarreta a incapacitação dos indivíduos acometidos. Apesar do aumento de MMPs, no fluido sinovial de pacientes com AR, estar associado à destruição da cartilagem articular, o papel dessas enzimas, no desencadeamento da inflamação e dor articulares não havia sido investigado. Desse modo, este estudo teve por objetivo avaliar a capacidade da metaloproteinase BaP1, isolada do veneno da serpente Bothrops asper, induzir eventos inflamatórios na articulação de ratos Wistar machos, analisando o aumento da permeabilidade vascular, o influxo leucocitário, a liberação de PGE 2 , TNF-α e MMP-9, a incapacitação articular e a participação do TNF-α e PGE 2 nesses eventos. Adicionalmente, foram investigados os efeitos da BaP1, em macrófagos isolados, quanto à expressão protéica das cicloxigenase-1 e -2 (COX-1 e -2), a liberação e a expressão gênica e protéica do TNF-α bem como a participação do fator de transcrição NF-κB nesse efeito. Ainda, foi avaliada a internalização da BaP1 em macrófagos em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que a injeção intra-articular de BaP1 induziu aumento da permeabilidade vascular e o acúmulo de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares na cavidade e membrana sinovial articulares. Estes eventos foram acompanhados pelo aumento das concentrações de PGE 2 , TNF-α e pró-MMP-9 no exsudato articular. Além disso, a BaP1 foi capaz de induzir incapacitação articular nos animais. O pré-tratamento dos animais com indometacina ou anti-soro anti-TNF-α reduziu, de modo marcado, a incapacitação e o influxo leucocitário, induzidos pela BaP1. No entanto, o pré-tratamento com anti-soro anti-TNF-α não alterou a liberação de PGE 2 induzida pela metaloproteinase. In vitro, a BaP1 induziu a expressão protéica de COX-2, mas não de COX-1 por macrófagos. Adicionalmente, essa metaloproteinase induziu a liberação e a expressão gênica e protéica de TNF-α naquelas células. A análise por microscopia confocal revelou que os pools citoplasmáticos de TNF-α foram aumentados pela BaP1 e co-localizaram-se com o complexo de Golgi. O pré-tratamento das células, com inibidores da funcionalidade desse complexo, brefeldina A e monensina, reduziu significativamente a liberação de TNF-α, induzida pela BaP1. Ainda, inibição da ativação do NF-κB, pelo composto TPCK, inibiu a expressão protéica do TNF-α, na vigência de ação da toxina. A incubação dos macrófagos com a BaP1 resultou na internalização dessa metaloproteinase. Em conjunto, esses resultados permitiram concluir que a BaP1 é capaz de induzir inflamação e nocicepção, na articulação de ratos. Estes fenômenos envolvem o aumento dos níveis de TNF-α e PGE 2 articulares. A expressão de COX-2 deve constituir uma etapa importante do mecanismo de ação da BaP1, para a produção da PGE 2 . Adicionalmente, a BaP1 induziu a liberação de TNF-α em macrófagos, evidenciando um efeito estimulatório direto sobre essas células. Essa liberação ocorre pelo aumento da expressão gênica e protéica do TNF-α, sendo dependente do fator de transcrição NF-κB. Esses dados representam a primeira demonstração da ação nociceptiva de uma metaloproteinase na articulação e da seqüência de eventos envolvidos na liberação de TNF-α, desencadeada por uma metaloproteinase de veneno de serpente. Ainda, os efeitos da BaP1, ora demonstrados, indicam que esta metaloproteinase pode ser uma ferramenta útil para os estudos da inflamação articular e para o entendimento das ações de metaloproteinases em processos inflamatórios. Estas enzimas devem constituir um alvo importante para o tratamento da sintomatologia de artropatias inflamatórias. Palavras-chave: Metaloproteinases; Artrite; Inflamação; Macrófagos; TNF-α; Dor. ABSTRACT FERNANDES, C.M. Studies on both articular inflammation and pain in rats and mechanisms involved in production of TNF-α by isolated macrophages, induced by BaP1, a metalloproteinase isolated from Bothrops asper snake venom. 2008. 117f. Tese (Doutorado em Farmacologia) -Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Inflammatory arthropathies, including rheumatoid arthritis, affects about 1% of the general population and are among the leading causes of disability and premature mortality, especially in the elderly. Though joint deformities may be prominent in these patients, joint pain is the most frequent complaint and the main reason to seek medical attention. Matrix metalloproteinases (MMPs) are abundant in inflamed articular joints and have been implicated in joint destruction in arthritis. However, MMPs have not been assigned a role in joint pain and in articular inflammatory events. In the present study we examined the ability of BaP1, a metalloproteinase from Bothrops asper snake venom, with structural homology to MMPs to induce, in vivo, inflammatory events in rat articular joints, analyzing vascular permeability (VP), leukocyte influx, PGE 2 , TNF-α and MMP-9 release, articular incapacitation, and participation of PGE 2 and TNF-α in those events. In addition, the effects of BaP1 in isolated macrophages were investigated by evaluation of cyclooxygenase (COX) -1 and -2 expression, release and gene and protein expression of TNF-α, and participation of NF-κB in this event. Internalization of BaP1 in isolated macrophages was also evaluated. Intra-articular injection of BaP1 induced increase of VP and a marked influx of polymorphonuclear and mononuclear cells in the cavity and synovial membrane of joints. Increased levels of PGE 2 , TNF-α and pro-MMP-9 were also detected in synovial exudates. Further, BaP1 induced articular nociception after its injection. Pretreatment of animals with indomethacin or antiserum anti-TNF-α significantly reduced nociception and leukocyte influx induced by BaP1 whereas pretreatment with antiserum anti-TNF-α did not affect BaP1-induced increase of PGE 2 levels. In vitro studies showed that BaP1 promoted a significant expression of COX-2 by macrophages without modification of constitutive expression of COX-1. Moreover, BaP1 induced the release and gene and protein expression of TNF-α. Immunofluorescence analysis showed increased intracellular pools of TNF-α colocalizated with Golgi complex. Inhibition of Golgi complex function by brefeldin A or monensin significantly reduced BaP1-induced release of TNF-α. In addition, inhibition of NF-κB by TPCK or TLCK abrogated TNF-α protein expression induced by BaP1. Moreover, incubation of macrophages with BaP1 resulted in internalization of this toxin. In conclusion, these results demonstrate that BaP1 is able to induce articular inflammation and nociception in rats. These events are dependent on PGE 2 and TNF-α release, and COX-2 expression by macrophages may be relevant for BaP1-induced PGE 2 production. In addition, BaP1-induced expression o TNF-α requires activation of NF-κB. Our data are the first experimental evidence that a MMP has pro-inflammatory and pronociceptive activities in joints. Targeting MMPs may thus provide both symptomatic and structural benefit in inflammatory arthropathies.
doi:10.11606/t.42.2008.tde-11092008-125741 fatcat:rtzkpbx3arbstgbtv6o2m2tkiy