Agradecimentos Foram tantas pessoas que me ajudaram, dividiram comigo cada experimento, discussão, enfim, sinto que essa dissertação é um pouco de cada um desses nomes que vou citar. Primeiro gostaria de agradecer minha família, meus pais, meus irmãos, cunhados, sobrinhos, enfim, sempre me apoiaram, aconselharam nos momentos difíceis e nas alegrias durante esse período. Principalmente à minha mãe por me inspirar sempre; meu pai por seus conselhos carinhosos e meu irmão, Ricardo, que fez a capa

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... o trabalho! Também gostaria de agradecer todos os meus amigos que fizeram parte da minha vida durante todo esse tempo. Amigos de perto e de longe, sem citar nomes, vocês sabem quem são. Agradeço a Deus pela vida de cada um de vocês. Agradeço a Profa. Dra. Eliane Candiani Arantes por ter me recebido de braços abertos no Laboratório de Toxinas Animais, por ter acreditado no meu trabalho e me ensinado tanto. Por ter vibrado a cada bom resultado e ter me incentivado a buscar sempre o melhor. Ao amigo Tibério Perini por ter sido meu parceiro neste trabalho, pelas cromatografias, plaquinhas de hemólise, horas e horas de ensaio cinético, discussões, amizade, trocas de aprendizado, os brigadeiros. Você é uma pessoa muito querida e competente, merece todo sucesso!!! A Cristiane Bregge pela "herança laquética". Pelos primeiros ensinamentos do laboratório, pelas conversas, e por tudo que me permitiu aprender com esse trabalho. Você tem o dom do ensino Bregge, está no caminho certo! Muito obrigada por tudo! A Karlinha por ser tão fundamental dentro do LTA, não apenas como técnica, mas pelos seus conselhos sempre na hora certa e por suas observações que fazem toda a diferença! A sua experiência e habilidade ajudaram muito no meu trabalho, obrigada!! E também a Iara por todo auxílio técnico, paciência e amizade! Ao "clã do F" -Fernanda, Fernando, Johara, Renata, Ernesto e agregados... "Há amigo mais chegado que irmão", vocês são mais que amigos, são irmãos, amo vocês! Levo pra todo o resto da minha vida com toda certeza!! Aos amigos do LTA -Pri Carmanham, Pri Shibao, Amanda, Gisele, Mateus, Elisa, Felipe, Manu, Carol Marroni muito obrigada pelo companheirismo e aprendizado do dia-a-dia! Carol, muito obrigada pelo auxílio no final do trabalho! Ao professor Cesar Rosa pela contribuição com o sequenciamento e pelos ensinamentos em espectrometria de massas; Ao professor Wagner dos Santos por ter me recebido em seu laboratório, ter dedicado um pouco do seu tempo para me ensinar, contribuir com idéias e discussão, muito obrigada! A professora Veridiana Rodrigues por ter me recebido em seu Laboratório em Uberlândia. Ao David e a Dayane por terem dedicado um pouco de seu tempo nesse trabalho! Muito obrigada a todo pessoal de Uberlândia pelos momentos agradáveis e produtivos que tive aí! A Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -funcionários, professores de disciplinas, colegas de pós-graduação! A CAPES pelo auxílio financeiro R e s u m o | i RESUMO Cordeiro, F. A. Isolamento, caracterização estrutural e bioquímica de uma nova fosfolipase A 2 presente na peçonha de Lachesis muta rhombeata. 112f. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, FCFRP-USP, Ribeirão Preto-SP, 2013. As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A 2 (PLA 2 ), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA 2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA 2 . A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA 2 apresentou alta identidade com PLA 2 s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA 2 . Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA 2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA 2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (V max ) e a constante de Michaelis (K m ) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de K cat = 0,41 min -1 , ou número de turnover, e a eficiência catalítica K cat /K m = 1,02 mM -1 min -1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA 2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e γglutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA 2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA 2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. Palavras-chave: Peçonha de serpente, Lachesis muta rhombeata, fosfolipase A 2 , edema . A b s t r a ct | ii ABSTRACT Cordeiro, F.A. Isolation, structural and biochemical characterization of a new phospholipase A 2 from Lachesis muta rhombeata venom. 112f. Thesis. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A 2 (PLA 2 ), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre-and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA 2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA 2 . The amino acid sequence of Lmr-PLA 2 showed high identity with PLA 2 s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA 2 . Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA 2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA 2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were V max = 1.147 nmol/min/mL and K m = 0.404 mM; K cat = 0.41 min -1 , or turnover number, e a catalytic efficiency, K cat /K m = 1.02 mM -1 min -1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and γglutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA 2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA 2 make this molecule promising for drug development.