DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a Deus, meu sustento e proteção. Aos meus pais João Batista Lopes e Maria Isabel Lopes por todo amor e doação a mim dedicado. AGRADECIMENTOS Agradeço especialmente à minha orientadora pela confiança, por me dar a oportunidade de recomeçar; pela paciência e tolerância; por sempre me apoiar e incentivar a ser melhor; e por ser um exemplo de pesquisadora por sua ética e senso de responsabilidade. À minha família, em especial aos meus pais. À minha mãe Isabel, meu

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... ande exemplo de resiliência, meu colo nos momentos difíceis, sempre tão compreensiva e amorosa. Ao meu pai, por todo seu esforço, por todos os conselhos, por ser meu porto-seguro. À minha irmã Lindamara, por me incentivar, compreender e ser minha grande amiga e companheira de vida. Agradeço todas as orações e ações de vocês sem as quais este trabalho não seria concretizado. Vocês são o projeto de Deus para minha vida. À querida Adriana, que foi não só minhas mãos e cérebro por ínúmeras vezes, foi uma amiga no melhor sentido desta palavra. Agradeço por todo o apoio e incentivo nos momentos que mais precisei e por ter confiado em mim. Às queridas Ana Sílvia e Adriana, por terem me acolhido tão bem desde os tempos do estágio. Ana, agradeço todos os conselhos, sua disposição em ajudar e contribuir e o carinho com que sempre me tratou. Adriana, sou muito grata por nossa convivência sempre tão leve e harmoniosa. Ao professor Rego, por ter me recebido em seu laboratório. Agradeço por ter ido muito além de suas atribuições profissionais, sendo conselheiro e compreensivo, quando mais precisei. À querida Cleide, que me acolheu desde os tempos do estágio com muita paciência, compreensão e disposição. À querida Priscila, por seus ensinamentos e grande colaboração para a execução deste trabalho. Às queridas Amélia e Josiane, por seus ensinamentos e sua disponibilidade em contribuir com este trabalho. Aos colegas pós-graduandos, em especial ao Thiago que, por diversas vezes, contribuiu e colaborou com este trabalho. Agradeço aos demais alunos da minha orentadora, Cristina e Talita por compartilharem suas experiências. Aos funcionários e aos demais alunos, pela disposição em ajudar e por suas contribuições para a resolução dos nossos problemas. Por fim, e, acima de tudo, a Deus. RESUMO Lopes, I A. Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma) 2018. 90f. Dissertação (Mestrado em Ciências). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018. Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFNγ, TNFα, TGFβ, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNFα and IFNγ por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFNγ mostrou-se diminuída em células NK NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFNγ, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK. Palavras -chave: 1. Fator de transcrição C/EBPG; 2. Células Natural Killer; 3. IFNγ. ABSTRACT Lopes, IA. Identification of Natural Killer cells regulation mechanisms by the transcription factor C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma) 2018. 90f. Dissertation (Master's degree in Science). Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2018. C/EBP (CCAAT/enhance-binding proteins) are a family of transcription factors involved in a variety of hematopoietic processes, regulating both terminal differentiation and cellular proliferation. Among these, it is known that C/EBP gamma (C/EBPG) is involved in the functional maturation of Natural Killer (NK) cells. However, the mediators of this regulation are unknown. NK cells are lymphocytes with effector functions of cytotoxicity and production of cytokines, both dependent on a dynamic equilibrium between the expression of activating and inhibitory receptors as well as cytokine receptors. The two functions (cytotoxic and secretory) make NK cells important components of hematopoiesis, able to eliminate susceptible targets as well as recruit other cells to amplify inflammatory responses. In face of incompatibility between target cells and NK effector cells, cytotoxic effects predominate; while in the absence of incompatibility, cytokine-mediated effects that influence other hematopoietic cells prevail. For example, cytokines such as IFNγ, TNFα, TGFβ, GM-CSF and IL-10, produced by NK cells, are potential regulators of hematopoietic stem cells (HSC). With the aim of studying the regulation of NK cells by C/EBPG, we isolated NK cells from transgenic C/ebpg knockout (KO) animals and controls to analyze their differential gene expression and function, with a special focus on hematopoiesis regulation. In order to identify potential C/EBPG target genes, we isolated C/ebpg-deficient and control NK cells by the use of sorting by flow cytometry and isolated RNA for gene expression analysis. Differential expression of C/ebpg target genes was performed by Real-time PCR for eight genes differentially expressed in the microarray analysis: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. When compared to controls, non-activated and IL-2-stimulated C/ebpg KO NK cells presented a tendency to have higher expression of Myd88. Cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17α, TNFα and IFNγ, obtained from NK culture supernatants, were verified by flow cytometry, after IL-2 activation. Among these cytokines, the production of IFNγ by C/ebpg-deficient NK cells was found to be reduced. To further characterize NK cells, we analyzed their frequency (Lineage -/CD3 -/NK1.1 + cells) and the expression of the receptors NKG2D, Ly49D and NKG2A, and both analyses presented similar expression between control or C/epbg KO NK cells. The functional subtypes of these cells were characterized according to the expression of CD27 and CD11b, which allow the identification of NK subpopulations as immature secretory, mature secretory, cytotoxic or tolerant. The KO animals showed higher percentage of secretory cells and percentual and numerical reduction of cytotoxic cells when compared to the NK control cells. In agreement, CD107a expression was 5-times lower in C/ebpg KO splenocytes than in control splenocytes after co-incubation with YAC-1 cells. In addition, a cytotoxicity assay by flow cytometry was performed. The fluorescent probe CTO (Cell Tracker Orange) was incorporated to YAC-1 cells, used as target cells. As a result, in the 10:1 NK:target cells ratio, C/ebp KO cells were less cytotoxic than NK control cells. We concluded that C/ebpg-deficient cells are dysfunctional, have a greater secretory potential and an altered expression of genes and cytokines as compared to their controls. The potential mediators revealed by our study, in particular, IFNγ, may be important targets for the regulation of NK secretory function.