Es wird über eine Routinemethode zur Trennung und Bestimmung der sieben wichtigsten 17-Ketosteroide im menschlichen Harn berichtet. Der Harnextrakt wird nach enzymatischer Hydrolyse und Solvolyse der Steroidkonjugate in zwei verschiedenen Lösungsmittel-Systemen durch Dünnschichtchromatographie nach dem Durchlaufvcrfahren getrennt. Auf diese Weise wird eine.gute Trennung sowohl der 11-Dcsoxy-wie auch der 11-oxygenierten 17-Kctosteroide erzielt. Die Zuverlässigkeit der Methode wurde durch

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... ndungsversuche und Mehrfachbestimmungen geprüft. routine method is reported for the separation and determination of the seven main 17-ketosteroids in human urine. The urine extract is separated by thin-layer Chromatography with the overrun technique in two different solvent systems after enzymatic hydrolysis and solvolysis of the steroid conjugates. By this method a good separation of the 11-desoxy-and the 11-oxygenated 17-ketosteroids was obtained. The reliability of the method was established by recovery experiments and by duplicate assays. Seit Entwicklung der Dünnschichtchromatographie sind verschiedene Methoden (l-6) zur Trennung der 17-Ketosteroide aus dem Harn beschrieben worden. Die Trennung der sieben wichtigsten im menschlichen Harn vorkommenden 17-Ketosteroide (Dehydroepiandrosteron, Androsteron, Ätiocholanolon, llß-Hydroxyandrosteron, 11 -Ketoandrosteron, 11 /9-HydroxyätiochoIanolon und 11-Ketoätiocholanolon) ist nicht ohne Schwierigkeiten möglich, da sich diese sieben Substanzen auf einer üblichen Chromatographieplatte von 20x20 cm, cl. h. auf einer Laufstrecke von etwa 18 cm, nicht genügend trennen lassen. Bei einer zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie (4) ist es schwierig, die Flecken zu lokalisieren, wenn man die Platte nicht besprühen will, um die Flecken sichtbar zu machen. Das erschwert aber eine quantitative Bestimmung. Eine optimale Trennung der sieben Steroide erreichen wir mit der "Durchlaufchromatographie". Zur Trennung und Isolierung der ll-Desoxy-17-ketosteroide einerseits und der 11-oxygenierten 17-Ketosteroide andererseits wird der Harnextrakt auf zwei verschiedenen Dünnschichtplatten in zwei verschiedenen Systemen chromatographiert. Zur Bestimmung der 11-oxygenierten Steroide, die in geringerer Menge ausgeschieden werden, wird eine größere Menge Harnextrakt verwendet. Methodik Reagenzien Äthanol (aldchydfrci): l / Äthanol (abs.) wird mit 3 g Natriumborhydrid an einer Füllkörperkolonnc destilliert. Methanol: p. a. (Fa. Ricdcl-dc Hac'n) wird über eine Füllkörperkolonnc destilliert. Athylacetat: wird mit l / JO Vol. 8proz. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dreimal mit Wasser ausgeschüttelt, über Calciumchlorid getrocknet und destilliert. Chloroform: p. a. (Fa. Merck). Acctatpuffcr pH 5,2: 32,4 g wasserfreies Natriumacetat und 7,15 m/ Eisessig werden mit dest. Wasser auf 250 m/ aufgefüllt. ß-Glucuronidasc/Aryl-Sulfatase aus Helix pomatia (Fa. C. F. ßoehringcr, Mannheim). Aluminiumoxid: neutral, Akt. II (Gebr. Giulini, Ludwigshafen). Aluminiumoxid G: für die Dünnschichtchromatographie (Fa. Merck). m-Dinitrobcnzol (Iproz. in aldehydfrciem Alkohol): Die Lösung muß im Dunkeln aufbewahrt werden und soll nicht älter als eine Woche sein. Zimmermann-Reagenz: zum Besprühen der Dünnschichtplattcn. 2proz. äthanol. m-Dinitrobenzol-Lösung und methanol. Kalilauge (7,5 g Kaliumhydroxid in 50 ml Methanol) werden vor Gebrauch im Verhältnis 2: l gemischt. Dchydrocpiandrosteron, Androsteron und Ätiocholanolon (Fa. Visier, Casatenovo Brianza (Como)). ll/?-Hydroxyandrosteron, 11-Ketoandrosteron, 11/3-Hydroxyätiocholanolon und 11-Ketoätiocholanolon (Fa. Ikapharm Ltd., Ramat-Gan, Israel). Hydrolyse (nach BAULIEU und JAYLE) (7). 20 m/ zentrifugierter Harn werden mit Eisessig auf pH 5,2 eingestellt, mit 50 /?-Glucuronidase/Aryl-Sulfatase und l m/ Acctatpuffcr pH 5,2 versetzt und 24 Stdn. bei 37° inkubiert. Dann säuert man mit 50proz. Schwefelsäure auf pH l an, löst im Harn 4 g Natriumchlorid und extrahiert dreimal mit je 50 m/ Athylacetat. Die vereinigten Extrakte werden 24 Stdn. bei 37° aufbewahrt und nach dem Abkühlen zweimal mit je 20 m/ N NaOH und zweimal mit je 20 m/ dest. Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat dampft man die Lösung im Vakuum ein. Wenn der Harncxtrakt stark gefärbt ist, wird seine Lösung in 3 m/ Chloroform durch eine kleine Säule aus Aluminiumoxid (Akt. II) (1x3 cm) filtriert und dreimal mit je 3 m/ und einmal mit 5 m/ Chloroform nachgespült. Das Eluat dampft man im Vakuum ein und nimmt den Rückstand in 10 m/ Methanoi auf. Zur Dünnschichtchromatographie dampft man l m/ der Lösung (= 2 m/ Harn, zur Bestimmung von Dehydroepiandrosteron, Androsteron und Ätiocholanolon) und 3 m/ der Lösung (= 6 m/ Harn, zur Bestimmung der 11-oxygenierten Steroide) in spitzen Zentrifugenröhrchen mit Schliff am Rotationsverdampfer im Vakuum ein. Dünnschicbtchromatograpbie