Síntese e caracterização de prolactina de camundongo (mPRL) e deu seu análogo (S177D-mPRL) [thesis]

Miriam Fussae Suzuki
que navegaram neste mesmo barco, dividindo as angústias e alegrias, em busca de resultados para novas publicações e congressos. Aos colegas pesquisadores do Centro de Biotecnologia -Dra. Nanci do Nascimento, Dra. Daniela pelos momentos de descontração e colaboração. Ao apoio do pessoal técnico e administrativo -Rute, Arlete, Junqueira, José Maria, Rosângela, Neide, Calixto, Cícero, Genivalda, Longino, Eduardo, Dirce que ajudaram na burocracia e fizeram do dia-a-dia do laboratório mais
more » ... ório mais agradável. Ao pessoal da limpeza, Edna, Néia, Beth, Sandra, que ajudaram a manter o laboratório limpo e organizado. Aos colegas do IPEN -Ana Claudia, A todos da CPG pela atenção, apoio e orientação técnica. Á Dra. Ameae Walker, da Universidade da Califórnia -EUA, pela idéia original da produção de antagonista de prolactina de camundongo. Ao IPEN, FAPESP (projeto 2007/59540-3), CNPq, CAPES pelo apoio financeiro e técnico. A todos da minha família pelo apoio, compreensão, companhia e incentivo. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE PROLACTINA DE CAMUNDONGO (mPRL) E DE SEU ANÁLOGO (S177D-mPRL) Miriam Fussae Suzuki RESUMO A prolactina é um neurohormônio que faz parte da superfamília das citocinas e está envolvida em inúmeros processos biológicos. Devido à sua ação endócrina, autócrina e parácrina, a prolactina está muitas vezes relacionada ao desenvolvimento de patogenias humanas como carcinomas e doenças autoimunes. Considerando-se que: a) diferença de 41% encontrada na sequência de aminoácidos da prolactina de camundongo em relação à humana, b) diferenças na glicosilação, fosforilação, e ligação ao receptor e, c) o fato que os modelos animais utilizados em ensaios in vivo com prolactina humana são geralmente ratos ou camundongos (modelos heterólogos), fica evidente que esses fatores podem interferir na interpretação dos resultados. Portanto, experimentos em sistemas homólogos seriam desejáveis. Esse trabalho descreve a obtenção pela primeira vez da mPRL no espaço periplásmico bacteriano, portanto na sua forma autêntica, ou seja, sem a metionina inicial, com expressão de 0,1 ± 13,2% µg/mL/A 600 . Para isso um vetor de expressão baseado no promotor λPL foi construído e utilizado como promotor constitutivo, com ativação a 37° C. Um processo de fermentação em biorreator, com rendimentos de expressão de até 2,5 µg/mL, e um processo de purificação com três etapas: concentração e purificação por hidrofobicidade (Phenyl Sepharose CL-4B) seguida por HPLC de fase reversa e HPSEC, foram também desenvolvidos. A mPRL purificada foi caracterizada por técnicas físico-químicas e biológicas em comparação com o padrão de referência da mPRL recombinante do Instituto Nacional de Saúde (NIH, EUA). A atividade biológica foi analisada e sua potência calculada foi de 33,9 ± 1,4 UI/mg. O mesmo vetor foi utilizado para a expressão do antagonista S177D-mPRL, mas o baixo nível de expressão obtido inviabilizou a sua produção no espaço periplásmico de bactérias. Como alternativa, optamos por produzir essa proteína em células CHO e clones com expressão da ordem de 1 µg/mL/dia foram obtidos. Com a expressão tanto da mPRL autêntica, como do S177D-mPRL, está aberto o caminho para o desenvolvimento dos estudos que envolvam modelos animais onde a mPRL e seu antagonista sejam fatores relevantes a serem considerados. ABSTRACT Prolactin is a neurohormone included in cytokine superfamily and involved in innumerous biological processes. Due to its endocrine, autocrine and paracrine action, it is, frequently, related to development of human pathologies, such as carcinomas and autoimmune diseases. Considering some factors: a) the difference of 41% between the amino acid sequence of mouse prolactin in relation to the human one, b) glycosylation, phosphorylation and receptor ligation differences, and c) the fact that the animal model used for in vivo assays with human prolactin are generally rats or mice (heterologous), it is evident that these factors might interfere in the interpretation of results. Therefore, experiments with homologous systems are desirable. This work describes, for the first time, the expression of mouse prolactin in the periplasmic space of bacteria, in its authentic form, i. e., without initial metionine, showing expression levels of 0.1 ± 13.2% µg/mL/A 600 . For this purpose, an expression vector based on λPL promoter was constructed and used as a constitutive form, with activation at 37° C. A fermentation process in bioreactor, with expression yields up to 2.5 µg/mL, and purification process with three steps: concentration and purification by hydrophobicity (Phenyl Sepharose CL-4B) followed by reverse phase HPLC and HPSEC, were also developed. The mPRL was purified and characterized by chemo physical and biological techniques compared to the recombinant standard reference from the National Institute of Health (NIH, USA). Its biological activity was analyzed and the calculated potency was 33.9 ± 1.4 UI/mg. The same vector was used for the expression of S177D-mPRL antagonist, but the low expression level obtained makes it impracticable to produce this protein in the periplasmic space of bacteria. As an alternative, the S177D-mPRL was produced in CHO cells and clones with expression level of about 1 µg/mL/day were obtained. The expression of both proteins, the authentic mPRL and the S177D-mPRL, opens the door for developing studies with animal models if mPRL and its antagonist might be considered relevant factors.
doi:10.11606/t.85.2011.tde-29062011-154905 fatcat:rs7mnyaq7rghxh27645vr6g6a4