Brucella melitensis Rev.1'in Sferoplast Yapısı ile Gen Transferine Açık Hale Getirilmesi

Ali USLU, Osman ERGANİŞ
2020 Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi  
GİRİŞ Brusellozis, α-Proteobacteria grubunda yer alan memelilerde bulaşıcı ve kronik enfeksiyona sebep olan bir hastalıktır (1). Enfeksiyon, yıllar içerisinde birçok isim değiştirmiştir, son olarak Sir. David Bruce'a ithafen "Brucella" olarak isimlendirilmiştir (2). Ülkemizde enfeksiyon, yoğun hayvan hareketleri ve geleneksel tarım uygulamalarındaki değişikliklere bağlı olarak uzun yıllardır gözlenmektedir. Türkiye'de Brusellozisin kontrol ve eradikasyonu için çalışmalar 1930 yılında
more » ... yılında başlamıştır. İlk resmi Brusella teşhis laboratuvarı 1951 yılında FAO/WHO Ortadoğu Brusellozis adı ile Merkezi Etlik Veteriner Kontrol Enstitüsü (Etlik VKE) bünyesinde kurulmuş ve daha sonra 1957 yılında Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsüne (Pendik VKE) taşınmıştır. Enstitü bünyesinde devlet destekli olarak 1960 yılında S19 aşısı üretilmeye başlanmıştır. FAO bünyesinde 1965 yılında koyun hastalıkları teşhis Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi https://dergipark.org.tr/tr/pub/duvetfd Araştırma Makalesi/Research Article Öz Brusellozis, ülkemiz ve dünya hayvancılığına zarar veren kronik bakteriyel bir enfeksiyondur. Brucella doğada plazmidi bulunmadığından plazmid kaynaklı mutasyonlara çok açık değildir. Ancak Brucella'nın uzun pasajlar sonrası bakteriyel adaptasyon ile elde edilmiş mutantları bulunmaktadır. Konjugasyon, lipofektamin ve elektroporasyon yöntemleriyle gen aktarımı yapılmaktadır. Sferoplast yapı, gen aktarımını kolaylaştırmada maya, mantar ve bitki hücrelerinde başarı ile kullanılmaktadır. Bu çalışmada kullanılan mutant pJQ200KS isimli intihar plazmidi 6,7 kb (Backbone 5,4kb + 1,25kb İnsert) gibi oldukça büyük bir genoma sahiptir. Genom büyüdükçe transformasyon zorlaşmaktadır. Çalışmada Brucella'nın kompetent hale getirilerek gen aktarımının elektroporasyon ile kolaylaşması için hücreler, çeşitli yöntemlerle ile sferoplast haline getirildi ve gen aktarımında ki etkisine bakıldı. Stok Brucella melitensis Rev.1 kanlı agara pasajlandı. Kültür, Brucella broth içerisinde 37 ºC'de 24 saat boyunca 160 rpm'da inkübe edildi. Santrifüj ile 8000xg 4 ºC'de 5 dakika pelet haline getirildi, PBS ile yıkanarak besi yerinden arındırıldı. Sferoplast uyarımı için 72 saat boyunca penisilin, ampisilin ve glisin ile indüklendi. Elektroporasyon ile gen aktarımda en etkin yöntemin glisin ile uyarım metodu olduğu belirlendi. Aktarımı zor olan ve 7 kb'dan daha büyük olan plazmidlerin aktarımı için uygulanan kompetent hücrenin sferoplast yapıya dönüştürülmesi metodunun gelecekte yapılacak çalışmalarda araştırmacılara avantaj sağlayacağı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Brucella, elektroporasyon, intihar plazmid, sferoplast Making Brucella melitensis Rev.1 Open to Gene Transfer with Spheroplast Structure Abstract Brucellosis is a chronic bacterial infection that harms livestock in our country and the world. Because of Brucella does not have a natural plasmid, it is not very open to plasmid-derived mutations. However, there are Brucella mutants obtained after long passages with bacterial adaptation. Gene transfer studies with conjugation, lipofectamine and electroporation are available. The suicide plasmid called pJQ200KS used in this study cannot be accomplished by conjugation since it does not have the λ pir gene region required for conjugation. It has been reported that as the size of the genome used for transfer increases, transformation becomes more difficult. Spheroplast structure has been successfully used in yeast, fungi and plant cells to facilitate gene transfer. There are two studies conducted for the transformation of Brucella into spheroplast structure. In studies to obtain spheroplasts from Brucella, after 24 hours of pre-culture, the spheroplast cells were exposed to the stimulation of penicillin, ampicillin and glycine for 48 hours, and penicillin and glycine were taken as the most effective stimulation method. Stock Brucella melitensis Rev.1 was passaged on blood agar. The culture was incubated in Brucella broth at 37 ° C for 24 hours at 160 rpm. 8000xg was pelleted for 5 minutes at 4 ° C by centrifugation, and the medium was cleared by washing with PBS. It was induced with penicillin, ampicillin and glycine for 72 hours for spheroplast stimulation. The structure has been made suitable for gene transfer. Since penicillin completely removes the cell wall structure of Brucella, unlike spheroplast formation, that it harms bacteria. It was determined that the most effective method in transferring with electroporation was stimulation with glycine. The method of transforming the component cell into a spheroplast structure for the transfer of plasmids that are difficult to transfer and larger than 7 kb will provide an advantage to researchers in studies.
doi:10.47027/duvetfd.825717 fatcat:c6jr7lpfj5bnnb27442tkbvr3m