Id3, inhibitor of DNA binding and cell differentiation: synthesis and conformational analysis of the full-length protein and its truncated analogues

Jaroslava Svobodová
2007
Die Dissertation behandelt die Synthese und Charakterisierung von Id3, welches das kleinste Mitglied der Id-Protein Familie ist. bHLH-Transkriptionsfaktoren werden negativ reguliert: durch Bildung von Heterodimeren mit diesen bHLH-Proteinen verhindert Id3 ihre Bindung an die DNA und demzufolge die Aktivierung der Transkription. Letztendlich führt dies zu zunehmender Zell-Proliferation und abnehmender Zell-Differentiation. Im Allgemeinen werden Id Proteine in proliferierenden, undifferentierten
more » ... undifferentierten normalen und Krebszellen exprimiert, dagegen ist ihre Expression gering in nicht-proliferierenden, terminal-differentierten Zellen oder sie sind gar nicht vorhanden. Id3 ist ein nützliches Target für die automatisierte Festphasenpeptidsynthese. Das komplette Protein sowie seine verkürzten und modifizierten Analoga sind auf Wang- oder Rinkamideresin aufgebaut worden unter Verwendung der Fmoc-Synthesemethode. Native chemical ligation wurde als alternativer Ansatz in Betracht gezogen, weshalb verschiedene Thioester synthetisiert wurden. Die beste Methode zur Herstellung der Thioester war diejenige unter Benutzung der Festphase mit seitenkettenbefestigten Peptiden. Die erhaltenen Polypeptide wurden mittels präparativer RP-HPLC gereinigt sowie über CD- und Fluoreszenzspektroskopie und Massenspektrometrie charakterisiert. Die konformellen Eigenschaften aller synthetisierten Id3 Polypeptide wurden mit Hilfe der Circulardichroismus-Spektroskopie untersucht und offenbarten ein komplexes Zusammenspiel zwischen den Id3 Unterdomänen. Das aus 41 Aminosäureresten bestehende Helix-Loop-Helix Motiv (umfasst die Id3 Aminosäuren 41-81) ist verantwortlich für die Wechselwirkung mit den bHLH-Proteinen. Es reagiert empfindlich auf einen Aminosäureaustausch innerhalb der beiden Helices. Insbesondere hat eine Mutation der zwei Tyrosinreste, die sich in Helix-1 und Helix-2 befinden, gezeigt, dass die Hydroxygruppe des Tyrosinrests in Helix-1 nicht wichtig für die Konformation ist. Demgegenüber ist der Tyrosinrest in Helix-2 entscheidend für die St [...]
doi:10.5283/epub.10566 fatcat:62sbbyrxjzapzjar7sdvbaon6a