In silico and experimental approaches to determining the aggregation propensity of biopharmaceutical products

Frank Hämmerling
2017
Danksagung Während der letzten Jahre haben mich viele Menschen begleitet und unterstützt, denen ich an dieser Stelle von ganzem Herzen danken möchte. Ich danke meinem Doktorvater Prof. Dr. Jürgen Hubbuch für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit an seinem Lehrstuhl anzufertigen, für die vielen fachlichen Diskussionen, sein entgegengebrachtes Vertrauen, seine professionelle Expertise und die exzellente Ausstattung des Labors. Prof. Dr. rer. nat. Christoph Syldatk danke ich für die
more » ... hme des Zweitgutachtens. Meinen Kollegen vom MAB danke ich dafür, dass sie nicht einfach nur Kollegen waren, sondern auch zu Freunden wurden. Danke für die schöne Zeit bei der Arbeit, bei den Kaffeerunden und bei den vielen gemeinsamen Freizeitaktivitäten. Danke auch an die " erste Generation" der Doktoranden am MAB, ganz besonders an Natalie Rakel und Patrick Diederich. Durch eure ausgezeichnete Betreuung während meiner Studien-bzw. Diplomarbeit am MAB habt ihr maßgeblich dazu beigetragen, dass ich diesen Weg eingeschlagen habe. Danke an Pascal Baumann und Kai Baumgartner, die während den Höhen und Tiefen der vergangen Jahre zu besten Freunden für mich wurden. und Sven Amrhein. Es war mir eine große Freude, mit euch zusammen zu arbeiten und auch viel Zeit außerhalb der Arbeit mit euch zu verbringen. Meinen Bürokollegen aus dem " alten" und " neuen" EBI möchte ich für die stets angenehme Atmosphäre im Büro, die vielen fachlichen Diskussionen und die amüsanten Gesprächeüber eine Vielzahl von Themen weit abseits von Proteinen, Chromatographie & Co. danken. Danke an meine fleißigen studentischen Helfer Weggen, die mich durch ihre Abschlussarbeiten und Arbeiten im Labor sehr unterstützt haben. Margret Meixner und Marion Krenz, die bei Fragen zur Bürokratie und häufig auch darüber hinaus immer eine große Hilfe waren, danke ich besonders. Thomas Lebe vom Institut für Mechanische Verfahrenstechnik und Mechanik (MVM) möchte ich für die Hilfe beim Anfertigen der TEM-Aufnahmen danken. Ein ganz besonderer Dank meinen Freunden von daheim, die immer einen schönen und 3 für mich wichtigen Ausgleich zu Karlsruhe dargestellt haben. Zu guter Letzt möchte ich meinen Eltern und meinem Zwillingsbruder Timo danken. Durch eure Unterstützung in jeglicher Hinsicht während des Studiums und der Promotionszeit habt ihr mir diesen Weg ermöglicht und mir zu jeder Zeit einen enormen Rückhalt gegeben. Danke für alles! " Nicht wie der Wind weht, sondern wie wir die Segel setzen, darauf kommt es an." -unbekannter Verfasser-4 Abstract Biopharmaceutical products, such as monoclonal antibodies and vaccines, have significantly improved the treatment and prevention of various diseases in the last decade. Aggregation of these products is on the one hand often exploited during the purification processes. On the other hand, aggregation also leads to product loss during manufacturing and storage and potential safety concerns due to immunogenic reactions after administration in patients can arise. Hence, knowledge about the current phase state, the aggregation propensity, and the influence of changing environmental conditions is necessary to control aggregation of biopharmaceuticals. The assessment of the aggregation propensity of biopharmaceutical products is still mainly based on heuristic approaches incorporating high sample material and time consumption, which is in most cases very limited during early stage process development. In silico methods help to overcome these drawbacks by drastically reducing the experimental effort. Furthermore, in silico methods help to generate a deeper understanding of the respective processes itself. This aspect is more and more moving into the spotlight during biopharmaceutical purification process development, as regulatory authorities are increasingly demanding a deeper process understanding, forwarding the quality by design guideline. The first two projects, that are presented in the subsequent sections, address the implementation of in silico methods during manufacturing of biopharmaceuticals. For vaccines that often comprise inactivated viruses, these in silico approaches are still hampered down to the present day, as they require enormous computational power due to the high complexity of such molecules. Nevertheless, there is a lack of fast, high-throughput compatible approaches to assess the colloidal and biological stability of this class of products. The third and fourth part of this thesis address this issue and present experimental approaches for the determination of surface properties of virus particles influencing their stability. The first part of this thesis is focused on the quantitative structure-activity relationship (QSAR) modeling of diffusion coefficients of proteins. QSAR modeling is an in silico method that correlates the properties of the molecule's structure with its experimental behavior. It can additionally be used for predicting the experimental behavior of new entities, as well as gaining insights into the underlying mechanisms. The diffusion coefficient of proteins can be used as a measure for protein-protein interactions. To be able to capture these protein-protein interactions, diffusion coefficients have to be determined experimentally until now. In this part of the thesis, a QSAR model for the diffusion coefficient was generated. Therefore, the diffusion coefficients of six proteins at different pH values and sodium chloride concentrations were determined experimentally. The protein 3D structures of these proteins were obtained from a protein data bank and adapted to the respective experimental conditions. Based on these protein 3D structures, molecular descriptors accounting for structure properties, electrostatics, and hydrophobicity were calculated in silico and related to the experimentally determined diffusion coefficients by partial least squares regressions. As a result, a QSAR model for predicting diffusion coefficients sensitive to protein type, pH value, and sodium chloride concentration with a coefficient of determination R 2 of 0.9 was generated. The predictive capabilities were evaluated with an external test set and the predicted diffusion coefficients showed a coefficient of determination R 2 of 0.91. The model has demonstrated the potential to 5 predict the diffusion coefficients of proteins in silico and, hence, enables the possibility to capture protein-protein interactions. Furthermore, the model was able to give a more detailed picture of the protein properties influencing the diffusion coefficient and the acting protein-protein interactions. As up to now, available crude models for the estimation of diffusion coefficients only accounted for the proteins' molecular weight. In the second part of this thesis, the methodology of QSAR was applied to model the precipitation of proteins with polyethylene glycol (PEG). Precipitation of proteins with PEG is considered to be an effective purification method for proteins, particularly as an alternative for costly chromatography processes. Additionally, the precipitation of proteins with PEG can be applied as a predictive tool to assess the long-term colloidal stability of protein formulations. Due to a lack of understanding of the underlying mechanisms, process development for these precipitation steps, however, still is mainly based on heuristic approaches and high-throughput experimentation. First reported models only account for the hydrodynamic radius of the proteins and PEG, and are not able to predict the complete precipitation curves. This deficiency was addressed in this project by modeling two parameters, namely the discontinuity point m * and the β-value, that completely describe the precipitation curve of a protein. m * depicts the PEG concentration at which protein solubility equals the protein concentration initially set, and the β-value the slope of the precipitation curve in the region where precipitation occurs. The generated QSAR models for m * and β are sensitive to protein type, pH, and ionic strength and exhibit a good correlation between observed and predicted data with a coefficient of determination R 2 of 0.9 and, hence, are able to predict complete precipitation curves for proteins. It was found that m * is mainly influenced by molecular structure properties and electrostatics, while β is mainly determined by electrostatics and hydrophobic properties. Model validation was performed by the application to an external test set of proteins that were not included in the generation of the models. The validation resulted in accurate predictions for two of the three investigated conditions. A deviation was observed for proteins with a molecular weight below 25 kDa. The presented project is the first reported approach enabling the in silico prediction of complete precipitation curves for proteins. The models help to accelerate process development for purification and formulation of biopharmaceuticals following the tenet of quality by design. The third part of this thesis addresses the colloidal and biological stability of H1N1 influenza A viruses. Current influenza vaccines are mostly formulated as liquids, which requires a continuous cold chain to maintain the stability of the antigens. To overcome this dependency and to make optimized vaccines available that exhibit an increased stability at ambient temperatures, the influence of manifold parameters on the colloidal and biological stability has to be systematically investigated and understood. In this part of the work, phase diagrams of H1N1 influenza A viruses were generated in the microliter scale, using an automated liquid handling station for a large set of initial H1N1 and sodium chloride concentrations at different pH values. After incubation for 40 days at 20 • C, the supernatant in each well with the respective conditions was evaluated for H1N1 mass recovery as a measure for colloidal stability, as well as for the remaining hemagglutination activity. These results serve as a basis for the subsequent part of this project, where a toolbox for the rapid assessment of the colloidal and biological stability was developed. This toolbox comprised the precipitation of H1N1 with polyethylene glycol as a predictive tool for the colloidal stability, and a combination of surface hydrophobicity determina-6 tion, zeta potential measurements, as well as and Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy as a predictive toolbox for the estimation of biological stability. The highest H1N1 mass recoveries were obtained at pH 6, the lowest ones at pH 4.5. It was found that there is a significantly lower H1N1 mass recovery for sodium chloride concentrations below 100 mM, and that recovery increases with increasing sodium chloride content. The highest values of remaining HA activity were determined at pH 9 and considerably lower relative remaining hemagglutination activities were observed for systems with low initial H1N1 concentrations. The precipitation of H1N1 with polyethylene glycol has proven its potential to replace time-consuming phase diagrams and to be a fast, high-throughput compatible predictive method to assess the colloidal stability of H1N1 virus particles. Combining surface hydrophobicity and zeta potential measurements and FT-IR sprectroscopy, it was possible to detect conformational changes in the surface proteins of the virus particles leading to a decrease in the hemagglutination activity. The combination of these methodologies depicts a powerful toolbox for the development of influenza vaccines with a preserved colloidal and biological stability and enables the rapid development of vaccine formulations that are stable at ambient temperatures. During the last part of this thesis, the influence of the production system on the surface properties of H1N1 influenza A viruses was investigated. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (A/PR) viruses cultivated either in adherent or suspension Madin Darby canine kidney (MDCK) cells show a different aggregation behavior. In a first step, the differences in the aggregation behavior were revealed by the particle size distributions obtained from differential centrifugal sedimentation and dynamic light scattering measurements. Virus particles produced in adherent MDCK cells exhibit a higher aggregation tendency under low-salt conditions compared to those derived from suspension cell culture. In a second step, all surface characteristics of the virus particles, that might cause the deviations in aggregation behavior were investigated. The zeta potential, surface hydrophobicity, Nglycosylation fingerprints of the major A/PR surface antigen hemagglutinin, and lipid composition were determined for the two virus samples produced in adherent or suspension MDCK cells. It was found that the virus particles produced in adherent cells have a more negative zeta potential and a significantly lower surface hydrophobicity compared to those produced in suspension cells. The lipid composition of both virus particle samples was found to be fairly identical. Differences were also revealed in the N -glycosylation fingerprints of the hemagglutinin surface protein. The hemagglutinin of the virus particles derived from the adherent MDCK cells comprise longer N -glycans, which is also the explanation for the lower surface hydrophobicity as well as the higher aggregation propensity. The longer N -glycans probably weaken the electrostatic interactions by steric hindrance. This work demonstrates the severe influence of the production system on the surface properties of both virus particles and the importance of carefully selecting an appropriate production system. Thereby, the aggregation tendency of the virus particles can be drastically reduced and, hence, product loss minimized and critical quality attributes can be guaranteed. In summary, the methods presented in this doctoral thesis represent powerful tools including both, in silico and high-throughput compatible methods, for predicting the aggregation propensity of biopharmaceutical products. The first-mentioned methods enable the in silico formulation and downstream process development for biopharmaceutical proteins and, thus, follow the demand of regulatory authorities to pursue the quality by 7 design guideline. The latter experimental methods enable the rapid development of optimized vaccines with an increased stability during production and formulation at ambient temperatures. 8 Zusammenfassung Arzneimittel auf Basis von biopharmazeutischen Herstellungsverfahren, wie zum Beispiel monoklonale Antikörper und Impfstoffe, haben die Behandlung und Prävention einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen im vergangenen Jahrzehnt erheblich verbessert. Die Aggregation dieser Produkte wird einerseits häufig während der Aufreinigungsprozesse ausgenutzt, andererseits führt die Aggregation zu einem Produktverlust während der Herstellung und Lagerung und zu potentiellen Sicherheitsrisiken durch immunogene Reaktionen nach der Verabreichung. Deshalb ist die Kenntnisüber den gegenwärtigen Phasenzustand, die Aggregationsneigung und den Einfluss sich verändernder Umgebungsbedinungen notwenig, um die Aggregation von Biopharmazeutika zu kontrollieren. Die Einschätzung der Aggregationsneigung biopharmazeutischer Produkte basiert noch immer hauptsächlich auf heuristischen Ansätzen, die zeitaufwendig sind und mit einem hohen Verbrauch an Probenmaterial einhergehen, das gerade in der frühen Prozessentwicklung sehr limitiert ist. In silico-Methoden helfen dabei, diese Nachteile zü uberwinden, in dem sie den experimentellen Aufwand erheblich reduzieren. In silico-Methoden ermöglichen es außerdem, ein tieferes Verständnisüber die Prozesse an sich zu erzuegen. Im Zuge des "Quality-by-Design"-Konzepts, das von den Zulassungsbehörden zunehmend verlangt wird, rückt dieser Aspekt während der Entwicklung von Aufreinigungsverfahren biopharmazeutischer Produkte zunehmend in den Fokus. Die ersten beiden Projekte, die in folgenden Abschnitten vorgestellt werden, befassen sich mit der Implementierung von in silico-Methoden während der Herstellung von Biopharmazeutika. Für Impfstoffe, die oftmals inaktivierte Viren beinhalten, ist der Einsatz dieser in silico-Methoden bis heute stark erschwert, da diese durch die sehr hohe Komplexität dieser Moleküle eine enorm hohe Rechenleistung benötigen. Dessen ungeachtet gibt es innerhalb dieser Produktklasse einen Mangel an hochdurchsatzfähigen Konzepten zur Beurteilung der kolloidalen und biologischen Stabilität. Der dritte und vierte Teil dieser Arbeit befasst sich mit dieser Thematik und stellt experimentelle Ansätze zur Bestimmung der Oberflächeneigenschaften von Viruspartikeln, die deren Stabilität beeinflussen, vor. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung von Diffusionskoeffizienten von Proteinen mittels quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungen (engl. quantitative structure-activity relationship (QSAR)). Die Modellierung mithilfe von QSAR ist eine in silico-Methode, die strukturelle Eigenschaften von Molekülen mit deren experimentellem Verhalten korreliert. Zusätzlich kann diese Methode dazu verwendet werden, um das experimentelle Verhalten von neuen Substanzen vorherzusagen und Verständnisüber die zugrunde liegenden Mechanismen zu generieren. Der Diffusionskoeffizient von Proteinen kann als Maß für Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Zur Bestimmung dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen müssen die Diffusionskoeffizienten bis heute experimentell ermittelt werden. In diesem Teil der Arbeit wurde ein QSAR-Modell für den Diffusionskoeffizienten entwickelt. Hierfür wurden die Diffusionskoeffizienten von sechs Proteinen bei unterschiedlichen pH-Werten und Natriumchlorid-Konzentrationen experimentell bestimmt. Die 3D-Proteinstrukturen dieser Proteine wurden von einer Proteindatenbank bezogen und an die entsprechenden experimentellen Bedingungen angepasst. Ausgehend von diesen 3D-Strukturen wurden in silico molekulare Deskriptoren berechnet, die die strukturellen Eigenschaften, die Elektrostatik und Hydrophobizität beschreiben und mittels Partial Least Squares Regression mit den experimentell bestimmten Dif-9 fusionskoeffizienten in Beziehung gebracht. Dadurch wurde ein QSAR-Modell mit einem Bestimmtheitsmaß (R 2 ) von 0,9 zur Vorhersage von Diffusionskoeffizienten erstellt, das die Art des Proteins, den pH-Wert und die Natriumchlorid-Konzentration berücksichtigt. Die prädiktiven Fähigkeiten des Modells wurden mithilfe eines externen Testsets beurteilt, dabei zeigten die Diffusionskoeffizienten ein Bestimmtheitsmaß R 2 von 0,91. Das Modell hat gezeigt, dass der Diffusionkoeffizient von Proteinen in silico vorhergesagt werden kann und ermöglicht dadurch die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Weiterhin konnte das Modell ein detaillierteres Verständnisüber die Proteineigenschaften liefern, die den Diffusionskoeffizienten beeinflussen undüber die vorherrschenden Protein-Protein-Wechselwirkungen Auskunft geben. Bisherige Modelle konnten lediglich das Molekulargewicht der Proteine berücksichtigen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Methodik von QSAR angewandt, um die Präzipitation von Proteinen mittels Polyethylenglykol (PEG) zu modellieren. Die Präzipitation von Proteinen mittels PEG wird als eine effektive Aufreinigungsmethode für Proteine angesehen, insbesondere auch als eine Alternative für kostenintensive chromatographische Verfahren. Zusätzlich kann die Präzipitation von Proteinen mittels PEG als ein prädiktives Instrument zur Beurteilung der Langzeitstabilität von Proteinformulierungen verwendet werden. Durch das fehlende Verständnis von den zugrunde liegenden Mechanismen, basiert die Prozessentwicklung dieser Präzipitationsschritte jedoch noch immer auf heuristischen Ansätzen und Hochdurchsatz-Experimenten (engl. high-throughput experimentation (HTE)). Erste veröffentlichte Modelle berücksichtigen ausschließlich den hydrodynamischen Radius der Proteine sowie des PEG und sind nicht dazu in der Lage, die vollständige Präzipitationskurve vorherzusagen. Dieses Defizit wurde in diesem Projekt durch die Modellierung zweier Parameter, dem Diskontinuitätspunkt m * und dem β-Wert, die die vollständige Präzipitationskurve eines Proteins beschreiben, aufgegriffen. m * stellt diejenige PEG-Konzentration dar, bei der die Löslichkeit des Proteins gleich der anfänglich eingestellten Proteinkonzentration ist, der β-Wert beschreibt die Steigung der Präzipitationskurve im Bereich mit auftretender Präzipitation. Die generierten QSAR-Modelle für m * und β berücksichtigen die Art des Proteins, den pH-Wert sowie die Ionenstärke und weisen eine hohe Korrelation zwischen den experimentellen und vorhergesagten Daten mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,9 auf. Daher können diese Modelle zur Vorhersage von vollständigen Präzipitationskurven verwendet werden. Es zeigte sich, dass m * hauptsächlich von den strukturellen Eigenschaften der Proteine und der Elektrostatik beeinflusst wird, während der Wert von βüberwiegend durch die Elektrostatik und hydrophoben Eigenschaften bestimmt wird. Die Validierung beider Modelle erfolgte durch ein externes Testset an Proteinen, das von der Modellbildung ausgeschlossen wurde. Die Validierung ergab präzise Vorhersagen für zwei der drei untersuchten Bedingungen. Eine Abweichung wurde für Proteine mit einem Molekluargewicht von weniger als 25 kDa beobachtet. Das vorgestellte Projekt ist der erste berichtete Ansatz der es ermöglicht, die vollständige Fällungskurve von Proteinen in silico vorherzusagen. Die Modelle helfen dabei, die Prozessentwicklung für die Aufreinigung und Formulierung von Biopharmazeutika zu beschleunigen und den Grundsatz des "Quality-by-Design"-Konzepts zu verfolgen. Der dritte Teil dieser Arbeit widmet sich der kolloidalen und biologischen Stabilität von Influenza-A-Viren. Gegenwärtige Influenzaimpfstoffe sind meist als Flüssigkeiten formuliert, was für den Erhalt der Stabilität der Antigene eine durchgehende Kühlkette er-10 forderlich macht. Um diese Abhängigkeit zuüberwinden und optimierte Impfstoffe mit einer erhöhten Stabilität bei Raumtemperatur verfügbar zu machen, muss der Einfluss verschiedener Parameter auf die kolloidale und biologische Stabilität systematisch untersucht und verstanden werden. In diesem Teil der Arbeit wurden Phasendiagramme von H1N1 Influenza-A-Viren im Mikrolitermaßstab mithilfe einer robotergestützten Pipettierplattform für eine Vielzahl unterschiedlicher Ausgangskonzentrationen von H1N1 und Natriumchlorid bei verschiedenen pH-Werten angefertigt. Nach einer Inkubationszeit von 40 Tagen bei 20 • C wurde derÜberstand in jedem einzelnen System bei den entsprechenden Bedingungen ausgewertet. Hierbei wurde sowohl die Wiederfindungsrate von H1N1 als Maß für die kolloidale Stabilität, als auch die verbleibende Hämagglutinations-Aktivität untersucht. Diese Ergebnisse dienen als Basis für den zweiten Teil dieses Projekts, bei dem eine Toolbox für die rasche Beurteilung der kolloidalen und biologischen Stabilität entwickelt wurde. Diese Toolbox beinhaltet die Präzipitation von H1N1 mittels Polyethylenglykol als prädiktives Tool für die kolloidale Stabiliät, sowie eine Kombination aus der Bestimmung der Oberflächenhydrophobizität, der Messung des Zeta-Potentials und der Fourier-Transformierten-Infrarotspektroskopie (engl. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy) als prädiktive Toolbox für die Abschätzung der biologischen Stabilität. Die höchsten H1N1-Wiederfindungsraten wurden bei pH 6 ermittelt, die geringsten bei einem pH-Wert von 4,5. Es wurde festgestellt, dass die Wiederfindungsraten von H1N1 bei Natriumchlorid-Konzentrationen unter 100 mM erheblich abnehmen und dass die Wiederfindung mit zunehmendem Natriumchlorid-Gehalt zunimmt. Die höchsten Werte für die verbleibende Hämagglutinations-Aktivität wurden bei pH 9 erzielt. Für Systeme mit einer niedrigen Ausgangskonzentration von H1N1 wurden deutlich niedrigere relative verbleibende Hämagglutinations-Aktivitäten bestimmt. Die Präzipitation von H1N1 mittels Polyethylenglykol hat das Potential bewiesen, zeitaufwendige Phasendiagramme zu ersetzen und als schnelles, hochdurchsatzfähiges prädiktives Verfahren die kolloidale Stabilität von H1N1-Viruspartikeln zu beurteilen. Durch die Kombination aus der Bestimmung der Oberflächenhydrophobizität und des Zeta-Potentials und der FT-IR-Spektroskopie war es möglich, konformativeÄnderungen innerhalb der Oberflächenproteine der Viruspartikel zu detektieren, die zu einer Abnahme der Hämagglutinations-Aktivität führen. Die Verknüpfung all dieser Methodiken stellt eine leistungsfähige Toolbox für die schnelle Entwicklung von Formulierungen von Influenzaimpfstoffen mit einer erhaltenen kolloidalen und biologischen Stabilität bei Raumtemperatur dar. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des Produktionssystems auf die Oberflächeneigenschaften von Influenza A-H1N1-Viren untersucht. Influenza-A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (A/PR)-Viren, die entweder in adhärent oder in Suspension wachsenden Madin Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen kultiviert wurden, weisen ein unterschiedliches Aggregationsverhalten auf. In einem ersten Schritt wurden die Unterschiede im Aggregationsverhalten durch Dichtegradientenzentrifugation und dynamische Lichtstreuung aufgezeigt. Viruspartikel, die in adhärenten MDCK-Zellen hergestellt wurden, weisen im Vergleich zu den Partikeln aus der Suspensionskultur, eine höhere Aggregationstendenz unter Niedrigsalzbedingungen auf. In einem zweiten Schritt wurden alle Oberflächeneigenschaften der Viruspartikel untersucht, die für diese Unterschiede im Aggregationsverhalten verantwortlich sein können. Das Zeta-Potential, die Oberflächenhydrophobizität, das N -Glykosylierungsmuster des bedeutendsten A/PR Oberflächenantigens Hä-11 magglutinin und die Lipidzusammensetzung der beiden in adhärenten oder in Suspensions-MDCK-Zellen hergestellten Virusproben wurde bestimmt. Es zeigte sich, dass die Viruspartikel die in den adhärenten Zellen hergestellt wurden im Vergleich zu denen in Suspensionkultur hergestellten, ein negativeres Zeta-Potential und eine deutlich geringere Oberflächenhydrophobizität besitzen. Die Lipidzusammensetzung der beiden Virusproben war annähernd identisch. Weitere Unterschiede zeigten sich im N -Glykosylierungsmuster des Oberflächenproteins Hämagglutinin. Das Hämagglutinin der Viruspartikel aus den adhärenten Zellen besteht aus längeren N -Glykanen, was sowohl die Erklärung für die geringere Oberflächenhydrophobizität als auch für die höhere Aggregationsneigung darstellt. Es wird angenommen, dass die längeren N -Glykane die elektrostatischen Wechselwirkungen durch eine sterische Hinderung herabsetzen. Diese Arbeit zeigt den starken Einfluss des Produktionssystems auf die Oberflächeneigenschaften der beiden Viruspartikel und die große Bedeutung der sorgfältigen Auswahl des geeigneten Produktionssystems. Dadurch kann die Aggregationsneigung der Viruspartikel erheblich reduziert und somit der Produktverlust verringert werden, sowie kritische Qualitätsmerkmale erreicht werden. Insgesamt stellen die in dieser Dissertation vorgestellten Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug zur Vorhersage der Aggregationsneigung biopharmazeutischer Produkte dar, die sowohl in silico als auch hochdurchsatzfähige Methoden beinhalten. Die zuerst beschriebenen Methoden ermöglichen die in silico Entwicklung von Formulierungen und Aufreinigungsprozessen für biopharmazeutische Proteine und ermöglichen dadurch das Verfolgen der von den Zulassungsbehörden geforderten "Quality-by-Design"-Richtlinie. Die zuletzt beschriebenen experimentellen Methoden ermöglichen die schnelle Entwicklung von optimierten Impfstoffen mit einer verbesserten Stabilität bei Raumtemperatur während der Produktion und Formulierung. 12 CONTENTS
doi:10.5445/ir/1000068418 fatcat:734knasrznegjcap4qsnculffe