RNA isolation from bloodstains collected on FTA cards – application in clinical and forensic genetics
Izolacja RNA z krwi zabezpieczonej na kartach FTA – zastosowanie w genetyce klinicznej i sądowej

Katarzyna Skonieczna, Jan Styczyński, Anna Krenska, Mariusz Wysocki, Aneta Jakubowska, Tomasz Grzybowski
2016 Archives of Forensic Medicine and Criminology  
Streszczenie Cel pracy: W ostatnich latach coraz częściej zwraca się uwagę na przydatność analiz RNA w badaniach z zakresu genetyki klinicznej oraz sądowej. Znaczącym problemem podczas prac nad RNA jest jednak jego niska stabilność wynikająca z aktywności RNAz. Tym samym unaocznia się potrzeba doskonalenia metod odpowiedniego zabezpieczania materiału biologicznego do analiz RNA. Rozwiązania technologiczne w postaci kart FTA (Whatman) mogą być użyteczne w kontekście zabezpieczania, transportu i
more » ... ania, transportu i przechowywania materiału biologicznego do badań RNA. Jednakże na ilość i jakość RNA uzyskiwanego z kart FTA mogą mieć wpływ różne warunki jego izolacji. Celem niniejszej pracy była analiza wydajności trzech metod izolacji RNA z krwi obwodowej zabezpieczonej na kartach FTA Classic Card (Whatman) oraz ocena stabilności RNA w plamach krwi zabezpieczonych na takich kartach. Materiał i metody: Badania przeprowadzono na plamach krwi zabezpieczonych na FTA Classic Card (Whatman) od 59 osób. RNA wyizolowano z wykorzystaniem High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics), Universal RNA/ miRNA Purification (EURx) oraz TRIzol Reagent (Life Technologies). RNA poddano ocenie ilościowej, a następnie przeprowadzono odwrotną transkrypcję oraz PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki: Przeprowadzone badania wskazują, że karty FTA Classic Card (Whatman) stanowią użyteczne podłoże do przechowywania w temperaturze pokojowej plam krwi do badań RNA. Ponadto wykazano, że metoda izolacji z wykorzystaniem odczynnika TRIzol Reagent (Life Technologies) charakteryzuje się najwyższą skutecznością i wydajnością w przypadku próbek przechowywanych do około 2 lat. Wnioski: Przeprowadzone badania wykazały, że karty FTA mogą stanowić użyteczne podłoże do badań RNA w genetyce klinicznej i sądowej. Słowa kluczowe: plamy krwi, RNA, degradacja RNA, ekspresja genów, karty FTA. Abstract Aim of the study: In recent years, RNA analysis has been increasingly used in clinical and forensic genetics. Nevertheless, a major limitation of RNA-based applications is very low RNA stability in biological material, due to the RNAse activity. This highlights the need for improving the methods of RNA collection and storage. Technological approaches such as FTA Classic Cards (Whatman) could provide a solution for the problem of RNA degradation. However, differ-Praca oryginalna Original paper archiwum medycyny sądowej i kryminologii Wprowadzenie Profilowanie DNA uzyskanego z materiału biologicznego w postaci krwi jest powszechnie wykorzystywane w genetyce sądowej do badań pokrewieństwa, indywidualizacji plam zabezpieczonych na miejscu zdarzeń kryminalnych, a także do identyfikacji ofiar katastrof czy wypadków. W ostatnich latach coraz częściej zwraca się również uwagę na przydatność analiz RNA w badaniach genetyczno--sądowych. Ostatnie doniesienia wskazują na użyteczność mRNA w odróżnianiu m.in. krwi obwodowej od menstruacyjnej [1], co może mieć istotne znaczenie w ustalaniu szczegółów przebiegu przestępstwa [za 2]. Ponadto analiza ekspresji genów we krwi może być również informatywna w określaniu przyczyny zgonu, np. na skutek niedotlenienia, uduszenia czy zażycia środków psychoaktywnych, takich jak metamfetamina [za 3]. Coraz więcej doniesień wskazuje również na użyteczność profilowania RNA z krwi w genetyce klinicznej. W szczególności wskazuje się na wysoką, potencjalną użyteczność profilowania RNA w diagnostyce nowotworów [4-7] czy chorób autoimmunologicznych [8] . Rosnące zainteresowanie analizami RNA w genetyce klinicznej i sądowej pociąga za sobą konieczność doskonalenia metod odpowiedniego zabezpieczania RNA. Istotnym problemem podczas prac nad RNA jest bowiem jego niska stabilność. Wszechobecne (zarówno w materiale biologicznym, ent methods of RNA isolation from FTA cards could have diverse effects on RNA quantity and quality. The purpose of this research was to analyze the utility of three different methods of RNA isolation from peripheral blood collected on FTA Classic Cards (Whatman). The study also aimed at assessing RNA stability in bloodstains deposited on FTA cards. Material and methods: The study was performed on peripheral bloodstains collected from 59 individuals on FTA Classic Cards (Whatman). RNA was isolated with High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics), Universal RNA/ miRNA Purification (EURx) and TRIzol Reagent (Life Technologies). RNA was subjected to quantitative analysis followed by reverse transcription and Real -Time PCR reaction. Results: The study has shown that FTA Classic Cards (Whatman) are useful tools for storing bloodstains at room temperature for RNA analysis. Moreover, the method of RNA extraction employing TRIzol Reagent (Life Technologies) provides the highest efficiency and reproducibility for samples stored for no more than 2 years. Conclusions: The FTA cards are suitable for collecting and storing bloodstains for RNA analysis in clinical and forensic genetics.
doi:10.5114/amsik.2016.66706 pmid:28677379 fatcat:ahv52jaor5bsfe3b5k6sqoi6fa