AGRADECIMENTOS Esses anos de pesquisa foram marcados de desafios e amadurecimento. Nesse período, aprendi que uma tese é a extensão da vida do autor. Dessa forma, para que algo de valor seja produzido, a pessoa deve primeiro criar algo de valor em si mesma, pois " entre as dificuldades se esconde a oportunidade"palavras de Albert Einsten. Assim sendo, nenhum ideal é realizado de forma fácil e sem esforço. Por esse motivo, agradeço a todos aqueles, que contribuíram de forma direta e indireta ao

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... ongo do desenvolvimento deste trabalho, que culminaram para o aprendizado e conclusão do doutorado. O meu muito obrigada, por possibilitarem essa experiência única, enriquecedora, gratificante e de grande importância para meu crescimento como profissional e como ser humano. Gratidão e humildade sempre! Agradeço a Deus por essa oportunidade e por fazer de mim merecedora de todo conhecimento que me foi dado, sabendo que ainda é o começo de toda uma caminhada longa, mas muito bem amparada sempre. Que assim seja! Aos meus grandes mestres da vida, que sempre me ajudaram com palavras de incentivo e carinho, sempre me impulsionando a dar o meu melhor e sempre acreditando em mim quando até eu mesma não acreditava mais. Meus pais, Luciane e Altino vocês são o alicerce mais forte da minha existência. Obrigada pela doação e compreensão. Aos meus irmãos, Joana e Julio Cesar, que mesmo longe, sempre me apoiaram com palavras confortantes e muito carinho. Amo vocês... A minha doce e querida filha Manuela, que a ela dedico este trabalho e minha vida, sem ela eu não seria nada e nada conseguiria, ela é minha força e inspiração para eu ser uma pessoa melhor todos os dias da minha vida. A você te dou a vida e o mundo, obrigada por existir em minha vida e me ajudar tanto mesmo sem saber. Amo incondicionalmente... A todos da minha família, tios, tias, primos e principalmente meus avós, Luiza e Caetano, por sempre me darem apoio quando mais precisei, meus sinceros agradecimentos a vocês. À minha orientadora Dra. Soraia Attie Calil Jorge, devo a você, um agradecimento especial, por aceitar compartilhar comigo esse desafio. Pela indescritível força de sua voz em meu trabalho, pelo belíssimo exemplo de sabedoria e humildade. Obrigada por acreditar em mim e pela indelével marca que deixou em minha vida acadêmica e pessoal, gratidão eterna. obrigada pela disponibilidade em ajudar sempre que necessário, pessoas que eu quero muito bem, por ter me incentivado e sempre ter uma conversa de conforto e sabedoria. Obrigada por essa convivência maravilhosa de companheirismo. Ao meu querido amigo Deny Anderson, por ser um anjo iluminado que chegou para dar mais luz aonde já existia, a única palavra para você é gratidão. Obrigada pelas palavras de conforto e pelo ombro quando precisei. Ao Instituto Butantan e ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia. A CAPES e à FAPESP pela bolsa de doutorado e pelos auxílios de projetos de pesquisas, respectivamente. "Há uma força motriz mais poderosa que o vapor, a eletricidade e a energia atômica: a vontade". Albert Einstein RESUMO PASCHOAL, J. F.B. Expressão gênica empregando pseudopartículas em células de mamíferos (HEK 293T e Huh 7.0) cultivadas em diferentes meios de cultura livres de soro. 2016. 114 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) -Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. O soro fetal bovino (SFB) é um dos componentes de maior valor agregado ao meio de cultura e pode causar dificuldades no processo de recuperação e purificação de um bioproduto. A adaptação de células em meios livres de SFB (serum free medium-SFM) e proteínas animais pode permitir a otimização do crescimento celular e expressão de genes heterólogos, facilitando a recuperação de proteínas recombinantes. Assim, estes parâmetros foram avaliados em células de mamíferos cultivadas em quatro SFM (Pro293a, VP-SFM, Hybridoma-SFM e CHO-S-SFM II). Estas células foram analisadas em relação ao seu crescimento, produção/consumo de nutrientes e capacidade de produzir vírus recombinantes e expressar proteína heteróloga, utilizando-se um sistema de expressão de pseudopartículas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da hepatite C (HCV), denominado ppHCV. A adaptação para as duas linhagens celulares (HEK293T e Huh7) foi realizada inicialmente com células que cresceram em 100% DMEM suplementado com 10% de SFB, em seguida, submetidos a uma adaptação sequencial para SFM. Para linhagem HEK 293T conseguimos adaptar em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, para linhagem Huh 7.0 houve adaptação nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente em SFM. Para a produção de partículas virais em células HEK 293T cultivadas em SFM, três vetores (pCMV-Gag/Pol, pCMV-E1/E2 e pCMV-RVGP) foram co-transfectados. As partículas virais obtidas foram quantificadas por qRT-PCR. A cinética de produção de ppHCVs mostrou que o melhor tempo para coleta foi em 48 horas para os três meios avaliados. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus em comparação com a eletroporação, sendo que quantificações de 5,30x10 3 cópias RNA/µL foram encontradas para ppHCVs produzidas em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM. Estas ppHCVs portando um RNA para expressão da proteína G (RVGP) do vírus rábico foram usadas para infectar células Huh 7,0 adaptadas em SFM. Células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína RVGP/10 6 células. Pseudo-partículas produzidas com diferentes concentrações do vetor pCMV-E1/E2, foram avaliadas por qRT-PCR realizada para detectar a entrada e adesão de ppHCV-RVGP, os resultados mostraram que este processo de entrada foi ineficiente. Em conclusão, as células cultivadas em SFM são capaz de crescer de uma maneira semelhante às cultivadas com SFB e também são capazes de produzir ppHCV-RVGP, sendo alternativas promissoras para a produção de proteínas e/ou vírus recombinantes. Palavras -chave: Células de mamíferos. Adaptação em meios livres de Soro (SFM). Pseudopartículas virais. Glicoproteína do vírus rábico (RVGP). ABSTRACT PASCHOAL, J. F.B. Gene expression using pseudoparticles in cultured mammalian cells (HEK 293T and Huh 7.0) in diferent serum free medium. 2016. 114 p. Thesis PhD The fetal bovine serum (FBS) is a component of higher value added to the medium, which may cause difficulty in the process of recovery and purification of byproduct. The adaptation to cell culture in the culture medium free of FBS and animal proteins can allow optimization of cell growth and expression of heterologous genes, facilitating recovery of recombinant proteins expressed in these cells. Thus, these parameters were evaluated in mammalian cells grown in four SFM (Pro293a, VP-SFM, Hybridoma-SFM and CHO-S-SFM II). These cells were analyzed for their growth, production / consumption of nutrients and the ability to produce recombinant viruses, and expressing heterologous protein using a pseudoparticles expression system murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV) called ppHCV. The adjustments to the two cell lines (HEK293T and Huh7) being initially carried out with cells grown in 100% of DMEM plus 10% FBS. These cells undergo a gradual adaptation, by FBS free medium. For HEK 293T line we adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-SFM, for Huh 7.0 line was adaptated in four different SFM. The consumption of substrates was different for each line in SFM. For production of viral particles in HEK 293T cells cultured in SFM, the three vectors (pCMV-Gal/Pol, pCM-VE1/E2 pCMV-RVGP) were co-transfected. The viral particles obtained were quantified by qRT-PCR. Kinetics of pseudoparticles production showed that the best collection time was 48 hours for the three tested media. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x10 3 RNA copies/ µL were found to ppHCVs produced in the cells adapted in Hybridoma-SFM. These ppHCVs carrying an RNA for expression of G protein (RVGP) of rabies virus were used to infect Huh 7.0 cells adapted to SFM. Infected cells produce about 10 ng RVGP protein /10 6 cells. Pseudoparticles produced with different concentrations of the vector pCMV-E1/E2, were evaluated of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP, these results showed that this process was inefficient. In conclusion, the cells cultured in SFM are able to grow in a manner similar to those grown with FBS, and are also capable of producing ppHCV-RVGP, with promising alternatives for the production of proteins and /or recombinant viruses. Keywords: Mammalian cell culture. Adaptation in serum free media (SFM). Viral Pseudoparticles. Glycoprotein of the rabies virus (RVGP).