FG-Nucleoporins (FG-Nups) are intrinsically disordered proteins (IDPs) located at the nuclear pore complex (NPC) where they form the permeability barrier of the NPC. The selective transport of cargoes, with a molecular weight above 40 kDa (>4 nm), across the NPC is mediated by nuclear transport receptors (NTRs). NTR mediated nucleocytoplasmic transport requires the direct interaction between NTRs and the phenylalanine-glycine motifs (FG-motifs) present in the FG-Nups of the NPC barrier. The

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... ctive crossing of NTRs through the ~30 nm permeability barrier of NPC has been shown to occur on the millisecond timescale. However, these fast transport times don't seem to correlate with the high specificities reported for several FG-Nup/NTR complexes, which are often associated with long lasting complexes. Thus, the understanding of the fast and selective nucleocytoplasmic transport resides in deciphering the molecular basis of the interaction between FG-Nups and NTRs. In my PhD thesis I have focused on understanding the binding mechanism between FG-Nups and NTRs by studying the structure, dynamics and kinetics of multiple FG-Nups upon binding to NTRs. I have shown, with different biophysical techniques like; multiparameter single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and stopped-flow spectroscopy that many FG-Nups are able to bind NTRs forming highly dynamic complexes. Moreover, most FG-Nups engage with different NTRs without undergoing a conformational which I have shown that it is linked to diffusion limited binding not driven by long-range electrostatic interactions. The work presented in this thesis contributed to the proposal of a model where FG-Nups interact with multiple minimalistic low affinity binding motifs with different NTR binding pockets with ultrafast kinetics allowing the fast NPC crossing of NTRs. This novel binding mechanism is due to the high dynamics of IDPs and can also explain why IDPs have enriched the development of higher organisms. Exceptionally, Nup214FG which is not forming part of the central FG-Nup barrier binds to NTRs like CRM1 or Importinβ with a different binding mechanism, where the binding is coupled to a conformational change. Moreover, these different FG-Nup/NTR binding mechanisms don't seem to be affected by the glycosylation of FG-Nups, which is a highly abundant posttranslational modification in the metazoan FG-Nups located at the NPC. In addition, motivated by the possibility of translating the in vitro results to a physiological environment and be able to study the structure of FG-Nups in situ at the NPC, I am developing a strategy that would improve the study of the structure and dynamics of the disordered regions of the FG-Nups in cells, paving the way toward the intracellular study of IDPs. II Zusammenfassung FG-Nukleoporine (FG-Nups) sind intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs), die sich im Kernporenkomplex (NPC) befinden, und dort die Permeabilitätsbarriere des NPCs formen. Der selektive Transport von Kargomolekülen grösser als ~40 kDa durch den NPC, wird durch Kerntransportrezeptoren (NTRs) bewerkstelligt. NTRs abhängiger nukleocytoplasmatischer Transport erfordert eine direkte Interaktion von NTRs mit Phenylalanin-Glycin Motiven (FG-Motiven), die in den FG-Nups der NPC-Barriere vorhanden sind. Es wurde gezeigt, dass der selektive Übergang der NTRs durch die ~ 30 nm NPC-Barriere im Millisekundenbereich abläuft. Diese schnellen Transportzeiten stehen im Konflikt mit den hohen Spezifitäten, die für einige FG-Nup/NTR-Komplexe berichtet wurden. Um nun diesen schnellen und selektiven nukleocytoplasmatischen Transport zu verstehen, ist die Entschlüsselung der molekularen Grundlage der Interaktion zwischen FG-Nups und NTRs notwendig. Während meiner Doktorarbeit habe ich mich darauf fokusiert, den Bindungsmechanismus zwischen FG-Nups und NTRs durch die Untersuchung der Struktur, Dynamik und Kinetik verschiedener FG-NUPs bei der Bindung an verschiedene NTRs, zu verstehen. Durch die Verwendung verschiedener biophysikalischer Techniken, wie Multiparameter Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (smFRET), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und Stopped-Flow-Spektroskopie, habe ich gezeigt, dass viele FG-Nups durch die Bildung eines hochgradig dynamischen Komplexes in der Lage sind NTRs zu binden. Ausserdem binden die meisten FG-Nups mit verschiedenen NTRs ohne eine signifikante Konformationsänderung zu vollziehen. Ich konnte zeigen, dass die Bindungsgeschwindigkeit diffussions-limitiert ist und nicht durch elektrostatische Interaktionen verursacht wird. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit trugen zu einem Modellvorschlag bei, bei dem FG-Nups mit mehrfach minimalistischen gering affinen Bindungsmotiven mit verschiedenen Bindungstaschen der NTRs mit ultraschnellen Kinetiken interagieren und damit den schnellen aber spezifischen Transport der NTRs durch den NPC erlauben. Dieser neuartige Bindungsmechanismus kommt durch die hohe Dynamik von IDPs zu Stande, und kann auch erklären warum IDPs sich in der Entwicklung höherartiger Organismen angereichert haben. Wie ich weiterhin zeigen konnte, bindet Nup214FG, welches nicht Teil der zentralen FG-Barriere ist, NTRs, wie CRM1 oder Importinβ, dagegen durch einen anderen Bindungsmechanismus. Bei diesem ist die Bindung an eine Konformationsänderung des ungefalteten Proteins gekoppelt. Des Weiteren, scheinen diese unterschiedlichen FG-Nup/NTR Bindungsmechanismen nicht durch die Glykosylierung der FG-Nups, einer sehr häufig vorkommenden posttranslationalen Modifikation von Metazoa FG-Nups, beeinflusst zu werden. Um die in vitro Ergebnisse in eine physiologische Umgebung übertragen zu können, bedarf es neuartiger Techniken um die Struktur der FG-Nups in situ am NPC zu untersuchen. Ich entwickelte daher eine Strategie, die die Studie der Struktur und der Dynamiken von ungeordneten Regionen von FG-Nups in Zellen möglichen machen wird, um den Weg zu intrazellulären Studien von IDPs zu ebnen. III Publication list 1. Mercadante, D.; Wagner, J.A.; Aramburu, I.V.; Lemke, E.A.; Grater, F., Sampling long versus short range interactions defines the ability of force fields to reproduce the dynamics of intrinsically disordered proteins. Journal of chemical theory and computation 2017. 2. Aramburu, I.V.; Lemke, E.A., Floppy but not sloppy: Interaction mechanism of FGnucleoporins and nuclear transport receptors. Seminars in cell & developmental biology 2017, 68, 34-41. 3. Kozma, E.; Nikic, I.; Varga, B.R.; Aramburu, I.V.; Kang, J.H.; Fackler, O.T.; Lemke, E.A.; Kele, P., Hydrophilic trans-cyclooctenylated noncanonical amino acids for fast intracellular protein labeling. Chembiochem : a European journal of chemical biology 2016, 17, 1518-1524. 4. Milles, S*.; Mercadante, D*.; Aramburu, I.V.*; Jensen, M.R.; Banterle, N.; Koehler, C.; Tyagi, S.; Clarke, J.; Shammas, S.L.; Blackledge, M., et al., Plasticity of an ultrafast interaction between nucleoporins and nuclear transport receptors. Cell 2015, 163, 734-745. 5. Hoffmann, J.E.; Plass, T.; Nikic, I.; Aramburu, I.V.; Koehler, C.; Gillandt, H.; Lemke, E.A.; Schultz, C., Highly stable trans-cyclooctene amino acids for live-cell labeling. Chemistry 2015, 21, 12266-12270. 6. Nikic, I.; Kang, J.H.; Girona, G.E.; Aramburu, I.V.; Lemke, E.A., Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature protocols 2015, 10, 780-791. 7. Lemke, E.A.; Schultz, C.; Plass, T.;Nikic, I.; Hoffmann, J.E.; Aramburu, I.V.;, Multiple cycloaddition reactions for labeling of molecules. US Patent App. 15/111,138, 2015 *Equal contribution IV