Rapid action of glucocorticoids in mast cells

Alice Bonicelli
2016
Statement of Authorship/ Erklärung I hereby declare that this dissertation is my own independent work. I have only used the given sources and materials and I have cited others' work appropriately. Hiermit erkläre ich, dass ich diese Dissertation eigenständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Wörtlich oder inhaltlich übernommene Stellen habe ich als solche gekennzeichnet. Alice Bonicelli, Dipl.Vet.Med. Karlsruhe, 26 th October 2016 I
more » ... ber 2016 I Zusammenfassung Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei Allergien. Sie werden über hochaffine membranständige IgE Rezeptoren aktiviert und ihre Wirkung ist schnell durch Glucocorticoide (GC) gehemmt. Der genau Wirkmechanismus ist dabei noch nicht bekannt. In der hier vorgestellten Arbeit wurde der Effekt von GC auf IgE-aktivierte Mastzellen aus dem Knochenmark (bone marrow derived mast cells -BMMCs) und aus der Bauchhöhle (peritoneal cell-derived mast cells -PCMCs) untersucht. Es konnten zwei verschiedene inhibierende Effekte der GC auf die Mastzellen gezeigt werden. Zum Einen, eine 10 -15 minütige Inhibition der Mastzell-Degranulation und zum Anderen, eine 30 -60 minütige Inhibition der Phosphorylierung der Mitogen aktivierte Proteinkinases (MAPKs). Um dabei die Rolle des Glucocorticoidrezeptor (GR) zu untersuchen, wurde durch ein Cre/loxP Rekombinationssystem eine GR "knock-out" Mutante in PCMCs generiert. Der inhibierende Effekt der GC auf die Mastzell-Degranulation und die MAPKs Phosphorylierung konnte in der GR "Knock-out" Mutante aufgehoben werden. Dies weist darauf hin, dass die inhibierende Funktion des GC über den GR vermittelt wird. Andere Studien haben postuliert, dass die Lokalisation des GR in der Membran der Zielzelle für den Wirkmechanismus der GC von Bedeutung ist. In der hier vorgestellten Arbeit, die Membransrekrutierung des GR ist durch das Palmitoylierungs-Motiv (ylcmktllls) des Rezeptors zu auftreten vermutet. Um die Rolle des Motivs in der Lokalisation des GR zu untersuchen, wurde ein Cystein an Position 665 des Motivs gegen ein Alanin (C665A) ausgetauscht und so eine Mutante hergestellt. Die Mutante "C665A" wurde zusätlich mit einem grün floureszierenden Protein (GFP) fusioniert (GR-GFP MutC665A). Sowohl die grün-floureszierende GR-GFP MutC665A-Mutante als auch ein grünfloureszierender Wildtyp-GR (GR-GFP) wurden stabil in RBL-2H3 Mastzellen transfiziert und die Lokalisation in der Plasmamembran bestimmt. Dabei werden Allergene durch die "Polymer pen lithography" auf eine Glasfläche aufgebracht und die transfizierten Zellen durch Bindung an die Allergene immobilisiert. Die Rezeptor-Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp-GR eine verminderte Rekrutierung des Rezeptors auf der Mastzell-Membran. Um den Mechanismus der Rezeptorrekrutierung noch genauer zu untersuchen, wurden Einzelmolekül-Tracking-Experimente durchgeführt. Dabei wurde ein GR Konstrukt benutzt, das an ein photoaktivierbares floureszentes Protein (mEos2-GR) gebunden ist. Dieses Konstrukt wurde transient in RBL-2H3 Zellen transfiziert und das interne Flouereszenssignal mittels Interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich die GR proximal der Membran frei bewegen können. Diese Bewegung konnte durch Behandlung der Zellen mit GC verlangsamt werden. Die Aktivierung der Zellen allein oder in Kombination mit ihrer Behandlung mit GC konnte die Bewegung des Rezeptors auch verlangsamen. Diese dynamischen Veränderungen der GR könnten darauf hinweisen, dass der Rezeptor direkt mit Zellmembranproteinen oder mit membrannahen zytoplasmatischen Proteinen interagiert, und das diese Interaktion für den Wirkmechanismus von GC auf Mastzellen von Bedeutung ist. II Abstract Mast cells are important immune cells in allergy. They function through activation of membrane high-affinity immunoglobulin E (IgE) receptors and their action is rapidly suppressed by glucocorticoids (GCs) via an unknown mechanism. In the work presented here, rapid effect of GCs was investigated in IgE-activated mouse bone marrow derived mast cells (BMMCs) and mouse peritoneal cell-derived mast cells (PCMCs). Two rapid inhibitory effects of GCs were observed in these cells on degranulation and on mitogen-activated protein kinase (MAPKs) activity. First, a 10 -15 min GC-mediated inhibitory effect on degranulation and second a 30 -60 min effect on MAPKs phosphorylation. To investigate the contribution of the glucocorticoid receptor (GR) to these rapid effects of GCs, a knock-out of the GR was specifically generated in the PCMCs through Cre/loxP recombination system. The rapid effects of GCs on degranulation and MAPKs phosphorylation were abolished in the GR knock-out PCMCs, indicating that the receptor mediates these functions of the hormone. Rapid mechanism of action of GCs has been postulated to occur through membrane localization of GR via a putative palmitoylation motif (ylcmktllls). To determine the involvement of this motif in the membrane recruitment of the GR, the cysteine residue at amino acid 665 in the motif was mutated to an alanine (C665A). The mutant "C665A" GR fused to a green fluorescent protein (GR-GFP MutC665A) and the wild-type GR-GFP were stably transfected into RBL-2H3 mast cells and their localization to the plasma membrane was investigated. This study was made feasible by the immobilization of the transfected cells on allergens printed on a glass surface by the technique of polymer pen lithography. The mutant receptor showed an impaired recruitment to the plasma membrane compared to the wild-type receptor. To generate more knowledge on the recruitment process, single molecule tracking experiments were carried out using a GR construct fused to a photo-convertible fluorescent protein (mEos2-GR). This construct was transiently transfected into RBL-2H3 mast cells and total internal reflection microscopy (TIRF) was carried out. The GR was found to be motile in the proximity of the plasma membrane but its movement was slowed down upon treatment of the cells with GC. A reduced motion of the GR was also observed upon activation of the cells by IgE crosslinking alone or in combination with GC. These dynamic changes in motility of the GR near the plasma membrane suggest a possible interaction of the receptor with plasma membrane components or cytoplasmic proteins in proximity of the plasma membrane that may be of relevance to the rapid action of GCs in mast cells. III
doi:10.5445/ir/1000065373 fatcat:ke6qshuznrbajknwbfyrooxesi