Ein vereinfachtes direktes Zählverfahren für Virus-Suspensionen ab 105 Partikel/ml

Rudolf Geister, Dietrich Peters
1963 Zeitschrift für Naturforschung. B, A journal of chemical sciences  
Herrn P rofessor Dr. A. B u t e n a n d t zum 60. G ebu rtstag Die bisher angewandten Verfahren erfordern ent weder Spezialgeräte (Sedimentations-Technik1), rela tiv hohe Partikelzahlen/ml (Agar-Filtration 2 1010/ml) oder beides (Spray-Verfahren 3^>109 /m l). Durch An wendung einiger Kunstgriffe gelingt es jedoch, ohne apparativen Aufwand absolute Virus-Titer ab 105 Teil chen/ml durch Vergleich mit wäßrigen Polystyrollatex-Suspensionen ähnlicher Partikelgröße in kurzer Zeit mit hoher
more » ... it hoher Verläßlichkeit zu bestimmen. Dazu werden, wie beim Spray-Verfahren, Virus-und Indikatorsuspensionen gemischt. Volumina <C 0,1 ml werden, um Pipettierfehler auszuschließen, auf der Analysenwaage miteinander vereinigt und durch leich tes Schütteln homogenisiert. Beide Komponenten kön nen bei hochgereinigtem Virus als von gleicher Dichte aufgefaßt werden; geringe Abweichungen fallen in die Fehlergrenze der Methode. Bei hohem Salz-bzw. Pro teingehalt der Virus-Suspensionen wird deren Dichte grob ermittelt (z. B. Klein-Pyknometer nach Gay-L u s s a c , zwei Dezimalen) und berücksichtigt. Aus den Wägungen lassen sich dann die Volumina mit aus reichender Genauigkeit bestimmen. Um selektive Ad sorption an der Gefäßwandung zu vermeiden, werden die elektronenmikroskopischen O bjektträger bald dar auf beschickt. Für salzarme Suspensionen eignen sich die üblichen Lochträger aus Platin-Iridium (Siemens-Typ). Salz reiche Fraktionen werden auf Kupfer-Netzträger prä pariert, die dann im bedeckten Gefäß auf einer dest. Wasser-Oberfläche schwimmend verbleiben, bis die Salze durch die Trägerfolie dialysiert sind. Der Sub strat-Tropfen trocknet erst nach Entnahme aus der Wasserdampf-Atmosphäre ein. Hohe Virus-Titer fordern geringe, niedrige große Tröpfchenvolumina. Zur Dosierung kleinster Mengen eignen sich selbst herstellbare hochelastische, gläserne M ikrokapillaren ("Siedekapillaren" des Chemikers), die man mit zwei Fingern kurz oberhalb der M ündung führt, während die andere Hand das knapp bleistift starke Glasrohrende hält (Kopflupe). Es gelingt, Tröpf chen von etwa 0,5 mm 0 zentrisch aufzusetzen und deren Höhe, falls notwendig, noch mit einem leeren Kapillaren-Bruchstück zu reduzieren, bis eine sehr dünne Flüssigkeits-Lamelle verbleibt. D erartige Tröpf chen erscheinen voll im Gesichtsfeld des Elmiskop I (erweiterte Tischverstellung) ; sie sind aber nur erfor derlich, wenn die Partikel-Verteilung in allen Bezirken der Stichprobe untersucht werden soll. Ihr Volumen 1 D. G. S h a r p , Proc. Soc. exp. Biol. Med. 70. 54 [1949]. 2 E. K e l l e n b e r g e r u . W . A r b e r , Virology 3, 245 [1957]. Be netzung der gesamten Trägerfläche mit einer Lamelle geringst möglicher Höhe verbraucht man etwa 10~4 ml (M inimaldosierung). Wegen der Gesichtsfeld-Begren zung im Elmiskop gelangt man jedoch zu ähnlichen Ausbeuten zählbarer Teilchen. Ungefähr 10~2ml (Ma ximaldosierung) werden erreicht, wenn man einen an nähernd kugelförmigen Tropfen vom anderthalbfachen Radius des Trägers präpariert. Zwischen beiden Men gen läßt sich jede Dosierung bequem vornehmen. Für die geschilderte Schwimmdialyse ist eine Benetzung bis zum T rägerrand zu vermeiden. Das Auftrocknen muß ohne wesentliche Störungen durch Grenzflächen-Erscheinungen erfolgen. Der Pro teingehalt der Virus-Suspensionen reicht meistens aus, um die T räger befriedigend zu benetzen. Hochgerei n ig te 4 oder stark verdünnte Fraktionen neigen infolge hoher Oberflächenspannung zu inhomogenem Eintrock nen. Beladen der Grenzflächen mit organischen Dämp fen (Einbringen der beschickten Träger in Äther-oder Amylacetat-Dampf) bewirkt in kurzer Zeit gutes Sprei ten des Probe-Tröpfchens. Hydrophobe Trägerfolien lassen sich nach Eintauchen in etwa 0,005-proz. Rinderserumalbumin-Lösung und Zwischentrocknung ebenfalls leicht benetzen. Elektronenmikroskopisch finden sich dann beide Partikel-A rten in gleichförmiger Verteilung. Häufig nimmt die Belegungsdichte zum Rande hin zu; im Tropfensaum können gelegentlich hohe Packungsdich ten auftreten. Disproportionierung beider Teilchen arten in Abhängigkeit vom Auftrocknungsort ließ sich statistisch nicht nachweisen, selbst dann nicht, wenn große V irus-Partikel (Vaccine) mit kleinen Referenz-Teilchen ( 8 8 m/< 0 ) gemischt worden waren. Ähnliche Beobachtungen liegen von anderer Seite 2 vor, auch für Goldsol-Partikel unterschiedlicher Größe 5. Ist die Gesamtfläche belegt, so sind bei 19-Loch-Trägern ~ 0,5%, bei Netzträgern dagegen ~ 5% der Fläche auswertbar. U nter Annahme homogener Verteilung und Mischung mit einer Indikatorsuspension gleicher P ar tikelzahl ergeben sich im Mittel als auszählbare Teil chen beider A rten : Partikel pro ml bei Minimal dosierung bei Maximal dosierung Loch träger Netz träger Loch-Netz träger träger 10u 5 -IO4 5 -IO5 (5 -IO«) (5 -IO7) 1010 5 -IO3 5 -IO4 5 -IO5 (5 -IO6) 109 5 -IO2 5 -IO3 5-104 5-105 108 50 5 -IO2 5 -IO3 5 -IO4 107 -50 5 • 102 ! 5 -IO3 106 --50 5 -IO2 105 --50 (eingeklammerte Werte nur bedingt verwertbar). 4 J. M a r q u a r d t , R. G e i s t e r u . D. P e t e r s , Arch. ges. Virus forsch., im Druck. 5 B . v . B o r r i e s ,
doi:10.1515/znb-1963-0319 fatcat:w5bq5zbkrvfulhgpdz6kbdzlxu