Superhelical DNA of polytene chromosomes Chironomus thummi
Суперспиральная ДНК политенных хромосом Chironomus thummi

M. A. Shurdov, A. D. Gruzdev
1988 Biopolymers and Cell  
Введение. Экспериментальные данные последних лет свидетельствуют 0 том, что молекулы ДНК в ядрах клеток эукариот, так же как у прокариот, находятся в суперспирализованном состоянии [1, 2] . Есть основания полагать, что транскрипционная активность генов существенно зависит от степени суперспиралыюсти их ДНК [3, 4] . Одним из путей выяснения этой зависимости является измерение суперспиралыюсти ДНК локусов политенных хромосом во время формирования или регрессии в них пуфов. Однако существующие
more » ... ко существующие сейчас методы не применимы для измерений in situ. Предлагаемый в настоящей статье вариант микрофлюориметрического метода вполне адекватен поставленной задаче. Его чувствительность, ограниченная в основном шумами регистрирующей аппаратуры, может быть достаточно высокой. Поскольку при применении метода не требуется информации о количестве ДНК в измеряемом объеме, он может быть также использован в макро-или полумикровариантах, в том числе при определении суперспиралыюсти ДНК после электрофореза непосредственно в гелях. Ниже излагается его применение для определения степени суперспиральности ДНК политенных хромосом хирономуса. Материалы и методы. В работе использовали личинок лабораторной линии Ch. thummi. Из ядер изолированных слюнных желез личинок четвертого возраста политенные хромосомы выделяли микроиглами в физиологическом растворе под бинокулярным микроскопом [5] . Состав раствора: 10 мМ трис-HCl, рН 7,3, 125 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 . Несколько наборов хромосом нанизывали на кончик стеклянной иглы, быстро погружали в 1 %-ный раствор низкотемпературной агарозы («Sigma», США) при температуре 36-37 °С и возвращали в физиологический раствор. В результате проведенных манипуляций на кончике иглы образуется микрокапля застывшей агарозы, содержащая политенные хромосомы. Для их депротеинизации использовали растворы ступенчато повышающейся (через каждые 0,2 М) ионной силы от 0,35 до 1,95 Μ NaCl, содержащие 50 мМ трис-HCl, рН 7,3. Через 20 мин 1,95 Μ раствор NaCl заменяли на исходный в обратном порядке. Микроэлектрофоретический анализ показал, что для удаления гистонов достаточно пятиминутного пребывания хромосом в 1,95 Μ растворе NaCl. В работе использовали также ДНК, выделенную из личинок Ch. thummi фенольным методом [6] . Средняя молекулярная масса этой ДНК, оцененная электрофоретически, превышала 4-Ю 6 . Измерения интенсивности флюоресценции проводили на микрофлюориметре собственной конструкции, который отличался от описанного ранее [7] использованием инвертированного микроскопа. Для определения степени суперспиральности (σ) суперспирализованную ДНК (сДНК) депротеинизированных политенных хромосом окрашивали различными концентрациями (С) бромистого этидия (БЭ). Для каждого препарата измеряли интенсивность флюоресценции БЭ, связанного с сДНК, до (1 С ) и после (1 П ) мягкой обработки препарата ДНКазой I или рестриктазой EcoRI. Условия обработки и измерения подбирали таким образом, чтобы исключить убыль нуклеотидиого материала, поэтому единственным результатом нуклеазной обработки могла быть релаксация супервитков хромосомной ДНК. При малых концентрациях красителя (1 с /1н)>1, поскольку отрицательно суперспирализованная ДНК обладает большим сродством к БЭ, чем линейная или релаксированная форма [8, 9] . По мере увеличения посадки красителя на сДНК число отрицательных супервитков падает до нуля, а затем начинается образование положительных супервитков. У этой формы (1 с /1н)<1. Вполне очевидно, что при (1 С /1 Н ) = 1 константа связывания (К) и число мест посадки (v 0 ) красителя на суперспирализованной и линейной молекулах ДНК совпадают. Зная плотность посадки красителя в этих условиях, нетрудно вычислить степень ее суперспиральности [1]: -σ 0 =1,44 ν 0 .
doi:10.7124/bc.00021e fatcat:rggvlzwxrnh45j6tamzuludaju