Untersuchungen zur anti-tumorigenen Wirkung von pflanzlichen Substanzen - Möglichkeiten der therapeutischen Intervention und Chemoprävention bei malignen Neoplasien [thesis]

Christopher Emanuel Kronski
2017
Ich, Christopher Emanuel Kronski, erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Thema: Untersuchungen zur anti-tumorigenen Wirkung von pflanzlichen Substanzen -Möglichkeiten der therapeutischen Intervention und Chemoprävention bei malignen Neoplasien selbständig verfasst, mich außer der angegebenen keiner weiteren Hilfsmittel bedient und alle Erkenntnisse, die aus dem Schrifttum ganz oder annähernd übernommen sind, als solche kenntlich gemacht und nach ihrer
more » ... und nach ihrer Herkunft unter Bezeichnung der Fundstelle einzeln nachgewiesen habe. Ich erkläre des Weiteren, dass die hier vorgelegte Dissertation nicht in gleicher oder in ähnlicher Form bei einer anderen Stelle zur Erlangung eines akademischen Grades eingereicht wurde. Freising, 04.11.2016 Christopher Emanuel Kronski Inhaltsverzeichnis: Zusammenfassung Malignome stehen weltweit nach Herzkreislauferkrankungen und Infektionskrankheiten an dritter Stelle der Todesursachen. Das Mammakarzinom ist der häufigste letale Tumor der Frau. Neben den etablierten operativen, medikamentösen und radiologischen Therapieansätzen stehen auch zunehmend komplementärmedizinische Therapiemöglichkeiten im Fokus der Tumortherapie. Insbesondere Pflanzenstoffe wie Curcumin oder Pflanzenstoff-Derivate wie Artesunate, eignen sich hierfür aufgrund ihrer optimalen Wirkungs-/Nebenwirkungsverhältnisse. Die molekularen Wirkmechanismen von Curcumin und Artesunate sind bis jetzt noch nicht gänzlich entschlüsselt. Ohne genaues Verständnis der Wirkmechanismen sind sie nicht in der klinischen Tumor-Therapie einsetzbar. Zur Klärung weiterer zellulärer Regulationspunkte soll in der vorliegenden Arbeit die Wirkung von Curcumin auf Ebene der miRNAs untersucht werden. Wir konnten zeigen, dass Curcumin das miRNA-Expressionsmuster von metastasierenden Mammakarzinom-Zellen moduliert. Via Micro-Array-Untersuchungen filterten wir miR181b heraus, die mehr als 3-fach überexprimiert war und deren mögliche Zielgene eine große Schnittmenge mit den bereits bekannten Zielmolekülen der Curcumin-Wirkung haben. Wir haben die miR181b-Expression durch knock in-und knock out-Experimente beeinflusst und zudem zur Validierung des Kausalzusammenhangs zwischen miR181b-Expression und der Curcumin-Wirkung Doppelmodulationsexperimente durchgeführt. Hierbei gelang es uns zu zeigen, dass die proinflammatorischen Zytokine CXCL1 und -2, sowie die mit der Apoptose assoziierten Gene BCL-2 und SURVIVIN nach miR181b-Überexpression inhibiert werden. Ebenso konnte eine Inhibierung der Expression von MMP-1 und -3 nachgewiesen werden, welche mit der Invasionsfähigkeit von Tumorzellen korreliert. Untersuchungen der Malignom-korrelierten Zellfunktionen ergaben, dass miR181b sowohl die Proliferation als auch die Invasivität der Tumorzellen beeinflusst. Die in vitro gefundenen Ergebnisse ließen sich auch in einem murinen hämatogenen Metastasenmodell -in vivo -mit dem Nachweis einer geringeren Metastasenbildung unter miR181b-Überexpression bestätigen. Die Induktion von miR181b und Repression von CXCL1 nach Curcumin-Behandlung primärer Mammakarzinom-Zellen (ex vivo) macht eine Übertragung der Ergebnisse auf die klinische Ebene möglich. Diese Daten präsentieren miR181b als wichtigen Mediator der Wirkung von Curcumin auf molekularer Ebene und unterstreichen erneut das chemopräventive Potenzial dieser Substanz. Des weiteren könnte miR181b auch als Prädiktor für die Wirkung von Curcumin fungieren, um eine präzisere Differenzierung zwischen Respondern und Non-Respondern zu ermöglichen. Genauso wichtig wie die Entschlüsselung des Wirkmechanismus einer Substanz ist die Klärung einer Resistenz-Entstehung. Als weitere potenzielle, chemopräventive Substanz haben wir Artesunate bzgl. ihrer anti-tumorigenen Eigenschaften untersucht. Hierbei konnten wir feststellen, dass die metastasierende Mammakarzinom-Zelllinie MDA-MB-231 im Laufe der Behandlung eine Resistenz gegenüber Artesunate entwickelte. Diese manifestierte sich in einer anfänglichen, später jedoch ausbleibenden Hemmung der Tumor-assoziierten Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFκB. Die steigende Präsenz von AP-1 und NFκB führt zu einer zunehmenden Resistenz gegenüber Apoptose, was auch in einer vermehrten Expression von BCL-2 und einer Reduktion von BAX resultiert. Die beiden mit dem programmierten Zelltod assoziierten Gene zeigten einen in Richtung Apoptose-Resistenz verschobenen Quotienten (BAX/BCL-2). Des Weiteren konnten wir zeigen, dass es mit Erreichen der Resistenz zu einer deutlichen Überexpression von MMP-1 kommt, deren Relevanz bzgl. der Tumorprogression bereits bekannt ist. Nur durch das Verstehen einer Resistenzentwicklung lassen sich zuverlässige Aussagen über mögliche Responder und Non-Responder machen. Je detaillierter das Wissen über die molekularen Wirkmechanismen von Naturstoffen ist, um so zielgerichteter können Substanzen wie Curcumin und Artesunate in die therapeutische Praxis integriert werden. Summary 4 Summary In causes of death, cancer ranks third worldwide, after cardiovascular and infectious diseases. Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women. Next to established surgical, drug and radiological forms of therapy, more and more complementary and alternative approaches are brought to attention for cancer therapy. In this context phytopharmaceuticals such as Curcumin, or derivates of phytopharmaceuticals such as Artesunate, play an important role as they show an excellent effect to side effect ratio. To this day, the underlying molecular mechanisms of Curcumin and Artesunate are not yet fully understood. Without knowing the detailed molecular mode of action, both substances cannot be applied in clinical tumor therapy. In order to further clarify the mechanisms of Curcumin, the here presented thesis should specify Curcumin's mode of action regarding microRNAs. Thus we could show Curcumin modulates the miRNA expression pattern of breast cancer cells. Using Microarray expression profiling we found miR181b, which was elevated 3-fold and whose putative targets build a large overlap with the already known molecular targets of Curcumin. We modulated miR181b expression by knock-in and knock-out experiments and performed sophisticated double modulation experiments to validate the causality between miR181b expression and curcumin effect. In particular, we show that miR181b overexpression leads to inhibition of proinflammatory cytokines CXCL1 and -2 and apoptoses associated genes BCL-2 and SURVIVIN. In the same way we showed a inhibited expression of invasiveness correlated MMP-1 and -3. Investigation of tumor associated cell functions results in an interaction between miR181b and tumor cell proliferation and invasivness. The findings in vitro could be confirmed in vivo in a murine model of heamatogenous metastasis, by detection of a lower number of metastases while miR181b overexpression. The induction of miR181b and the resulting repression of CXCL1 following Curcumin treatment of primary breast cancer cells (ex vivo) provides transferability to the clinical situation. These data present miR181b as an important mediator of the effect of Curcumin on molecular level and points out the chemopreventive potential of the substance. Furthermore miR181b seems to be well suited as a predictor of Curcumin efficacy, to get a better differentiation between responder and non-responder. As important as to know the way of action of a drug, it is equally important to understand the mechanisms that lead to resistance. As a further potentially chemopreventive substance we analyzed Artesunate concerning its anti-tumorigenic properties. In this case we observed an occurring resistance during the process of treatment of metastatic breast cancer cells (MDA-MB-231) with artesunate. This is shown by an inhibition of tumor associated transcription factors AP-1 and NFκB in the beginning of the experiment, till in the end the effect stays away. The rising amount of AP-1 and NFκB leads to a progressive resistance against apoptosis, reflected also in an increased expression of BCL-2 and a decreased level of BAX. Both genes show a shift of their ratio (BAX/BCL-2) towards apoptosis resistance. Additionally, with progressing resistance, metastatic breast cancer cells (MDA-MB-231) produce higher amounts of MMP-1, well known to be relevant in tumor progression and metastasis. Only the understanding of a developing resistance allows a safer discrimination between responder and non-responder. The more detailed the knowledge of the molecular effects of natural compounds, the better substances like Curcumin or Artesunate can be integrated into new therapeutic schemes. Das Mammakarzinom 5 2 Das Mammakarzinom Nach Schätzungen der WHO (World Health Organization) beträgt die Inzidenz von Malignomen bei Frauen im Jahr 2012 ca. 6,6 Millionen weltweit. Den größten Anteil davon (ca. 25 %) stellen maligne Neoplasien der Brust (ca.
doi:10.5282/edoc.21420 fatcat:y4nogwqtlrcq3m2jhkxlqjrfcm