Objective Mycobacterium bovis BCG is used as a live vaccine against tuberculosis. RecAdependent homologous recombination is a major driving force of bacterial evolution. Therefore a RecA phenotype is recommended for all live vaccines. RecA life vaccines demonstrate increased genetic stability and are favourable because of a reduced risk of reversion to virulence. Characterization of marked recA mutants provided proof of principle that persistence in the host, which is a major criterion of

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... e efficiency, is not affected by the deletion of recA. However, due to the presence of antibiotic resistance markers such a recombinant strain may not be used in human vaccination trials. The aim of this study was to generate unmarked recA deletion mutants in phylogenetically different Mycobacterium bovis BCG substrains. Methods Six BCG vaccine substrains were selected based on the following criteria: The substrains had to feature a complete historical documentation with date of lyophilization for the primary seed lot, protective efficiency in case control studies, an official WHO, FDA or government issued permission for human use, and a molecular description (regions of difference, and single nucleotide polymorphisms in comparison to M. bovis AF2122/97). Identity of the substrains was confirmed by molecular techniques. Mixed cultures with more than one genotype were excluded. Unmarked inactivation of recA was achieved with a suicide (i.e. non-replicative) knock-out plasmid containing a partially deleted recA allele flanked by a hygromycin and a kanamycin selectable marker and a levansucrase (sacB) counterselectable marker. SacB induces sucrose sensitivity in mycobacteria and allows the isolation of allelic exchange mutants in a two-step selective process. M. tuberculosis H37Rv recA was cloned into the suicide vector together with approximately 1.2 kbs of flanking genomic DNA. The genomic sequences of the cloned region are identical in M. bovis AF2122/97 and M. tuberculosis H37Rv. An in-frame stop codon (following amino acid residue 169) was introduced in the cloned recA instead of an internal 1.2-kb PstI fragment. BCG substrains were grown in Middlebrook media; electrocompetent cells were produced and transformed with the suicide knock-out plasmid. Following selection of single-crossover transformants at the recA locus on hygromycin B containing media, deletion mutants resulting from intramolecular recombination were isolated after a counterselective step on 10% sucrose containing media. The respective genotypes were determined by PCR and Southern blot analyses. Results Unmarked recA deletion mutants were obtained in BCG substrains Frappier, Pasteur, and Denmark. In BCG Tice and BCG Phipps, single-crossover mutants for the recA locus could be isolated. After counterselection, only reversion to wild-type allele or persistence of the single-crossover genotype was noted. In BCG Russia only illegitimate recombinant mutants were obtained. Illegitimate integration excludes generation of recA deletion mutants as an intramolecular recombination does not occur. Sequencing of the recA locus revealed a mechanistic explanation for the inability to obtain homologous recombination in BCG Russia. This substrain has an insertional single nucleotide polymorphism (SNP) in recA causing translational frame shift and truncation of RecA. Thus, tuberculosis vaccine strain BCG Russia is a natural recA mutant. Conclusion The presented strategy allows generation of unmarked allelic exchange mutants for the recA locus in M. bovis BCG and delivered new recA vaccine candidate strains that base on three well-documented BCG vaccine substrains. The mutants are free of genomic selectable and counterselectable markers. The constructed suicide vector backbone for the generation of unmarked allelic exchange mutants may be used for other allelic exchange experiments in mycobacteria. BCG Russia recA SNP provides an explanation for the observed high degree of in vitro evolutional stasis. Outlook The deletion of recA in M. bovis BCG leads to a stable genome in this live vaccine reducing the risk of further attenuation or reversion of virulence in the process of vaccine production and in vaccinees. The availability of recA mutants in M. bovis BCG substrains facilitates the construction of heterologous antigen expression vectors for the intracellular compartment with stable expression of recombinant antigens profiting from BCG's long generation time and persistence in the host. Hintergrund Mycobacterium bovis BCG wird als Lebend-Impfstoff gegen Tuberkulose verwendet. RecA-abhängige homologe Rekombination ist eine grosse treibende Kraft der bakteriellen Evolution. Daher wird ein RecA-Phänotyp empfohlen für alle Lebend-Impfstoffe. RecA Impfstoffe zeigen eine erhöhte genetische Stabilität und sind vorzuziehen, da ein geringeres Risiko der Wiedererlangung der Virulenz besteht. Charakterisierung von markierten recA-Mutanten erbrachte den Nachweis, dass die Persistenz im Wirt, die ein wesentliches Kriterium der Impfstoff-Effizienz ist, nicht betroffen ist von der Deletion von recA. Wegen der Präsenz von Antibiotika-Resistenz-Markern, kann ein solcher rekombinanter Stamm nicht verwendet werden in Human-Impfstudien. Das Ziel dieser Studie war es, unmarkierte recA-Mutanten in phylogenetisch verschiedenen Mycobacterium bovis BCG-Substämmen zu generieren. Methoden Sechs BCG-Impfstoff-Substämme wurden ausgewählt auf der Grundlage der folgenden Kriterien: Die Substämme mussten eine komplette historische Dokumentation mit Tag der Lyophilisation für die primären Seed-Lots, Daten über protektive Effizienz aus Fall-Kontroll-Studien, eine offizielle WHO-, FDA-und länderspezifische Zulassung für den menschlichen Gebrauch und eine molekulare Beschreibung (Regionen von Differenzen und Einzelbasen-Polymorphismen im Vergleich zu M. bovis AF2122/97) aufweisen. Die Identität der Substämme wurde durch molekularen Techniken bestätigt. Gemischte Kulturen mit mehr als einem Genotyp wurden ausgeschlossen. Unmarkierte Inaktivierung von recA wurde erreicht mit einem Suicide-Plasmid (d.h. nicht replikativ) mit einem teilweise deletierten recA-Allel, flankiert von einem Kanamycin-und Hygromycin-selektierbaren Marker und einem Levansucrase-Gen (sacB) als gegenselektionierbaren Marker. SacB induziert Saccharose-Sensibilität in Mykobakterien und ermöglicht die Isolierung von allelischen Austausch-Mutanten in einem Zwei-Schritt selektiven Prozess. M. tuberculosis H37Rv recA wurde geklont in den Suicide-Vektor zusammen mit rund 1,2 kbs flankierender genomischer DNA. Die Genomsequenzen der geklonten Region sind identisch in M. bovis AF2122/97 und M. tuberculosis H37Rv. Ein In-frame Stoppcodon (im Anschluss an Aminosäure 169) wurde in das geklonte recA eingefügt statt eines internen 1,2-kb PstI-Fragment. Die BCG-Substämme wurden kultiviert in Middlebrook-Medien; elektrokompetente Zellen wurden produziert und transformiert mit dem Suicide-Knock-out-Plasmid. Nach Auswahl der Single-Crossover-Transformanden für den recA-Genort auf Hygromycin B-haltigen Medien, wurden Deletions-Mutanten isoliert, die aus intramolekularer Rekombination resultierten. Nach einem Gegenselektionsschritt auf 10% Saccharose-haltigen Medien. Die jeweiligen Genotypen wurden durch PCR-und Southern-Blot-Analysen bestimmt. Ergebnisse Unmarkierte recA Deletions-Mutanten wurden in den BCG-Substämmen Frappier, Pasteur, und Dänemark isoliert. In BCG Tice und BCG Phipps, konnten Single-Crossover-Mutanten für den recA-Locus isoliert werden. Nach Gegenselektion wurde nur Rückkehr zum Wildtyp-Allel oder Persistenz des Single-Crossover-Genotyps festgestellt. In BCG Russia wurden nur illegitim rekombinante Mutanten erzeugt. Illegitime Integration schliesst die Generierung von recA-Deletions-Mutanten aus, da eine intramolekulare Rekombination nicht vorkommt. Die Sequenzierung des recA-Locus ergab eine mechanistische Erklärung für das fehlende Vorhandensein homologer Rekombination in BCG Russia. Dieser Substamm hat einen Insertions-Einzelbasenpolymorphismus (SNP) in recA, welcher einen translationalen Frame-Shift und eine Trunkierung von RecA verursacht. Daher ist der Tuberkulose-Impfstoffstamm BCG Russia eine natürliche recA-Mutante. Interpretation Die vorgestellte Strategie erlaubt die Generierung von nicht markierten allelischen Austauschmutanten für den recA-Genort in M. bovis BCG und lieferte neue recA-Impfstoff-Kandidaten-Stämme, die auf drei gut dokumentierten BCG-Impfstoff-Substämmen basieren. Die Mutanten sind frei von genomischen selektierbaren und gegenselektierbaren Markern. Der Rückgrat des konstruierten Suicide-Vektors für die Erzeugung von nicht gekennzeichneten allelischen Austauschmutanten kann auch für andere allelische Austauschexperimente in Mykobakterien verwendet werden. Der BCG Russia recA-SNP bietet eine Erklärung für den beobachtete hohen in-vitro evolutionsbiologischen Stillstand. Ausblick Die Deletion von recA in M. bovis BCG führt zu einem stabilen Genom in diesem Lebend-Impfstoff mit Verringerung des Risikos einer weiteren Abschwächung oder Rückkehr von Virulenzfaktoren im Produktionsprozess und in Geimpften. Die Verfügbarkeit von recA-Mutanten in M. bovis BCG-Substämmen ermöglicht die Konstruktion von heterologen Antigen-Expressionsvektoren für das intrazelluläre Kompartiment mit stabiler Expression rekombinanter Antigene. Dabei profitiert man von der langen Generationszeit und Persitenz von BCG im Wirt. ABSTRACT v Abstract Objective Mycobacterium bovis BCG is used as a live vaccine against tuberculosis. RecA-dependent homologous recombination is a major driving force of bacterial evolution (1). Therefore a RecA phenotype is recommended for all live vaccines (2-4). RecAlife vaccines demonstrate increased genetic stability and are favourable Outlook The deletion of recA in M. bovis BCG leads to a stable genome in this live vaccine reducing the risk of further attenuation or reversion of virulence in the process of vaccine production and in vaccinees. The availability of recA mutants in M. bovis BCG substrains facilitates the construction of heterologous antigen expression vectors for the intracellular compartment with stable expression of recombinant antigens profiting from BCG's long generation time and persistence in the host.