Komplexierung von siRNA zum spezifischen Knock Down von Luciferase in SKOV-3/Luc und 3T3 Zellen

Olivia Monika Merkel, Pharmazeutische Technologie Und Biopharmazie
2007
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Assay zur Untersuchung von PEIs als nicht-virale Vektoren für siRNA entwickelt. Hierbei diente PEI 25kDa als Kontrolle. Des Weiteren wurde PEI 5kDa (Low-Molecular-Weight-PEI "LMW-PEI") mit geringerer Verzweigung, PEI(25k)-g-PEG(550)35 (pegyliert) mit schwächerer Komplexierung und ePEI (ethoxyliert) mit kleinerem pKa-Wert und stärkerer Protonierung im Endosom verwendet. Es wurden die Transfektionsbedingungen und das N/P-Verhältnis der Polyplexe optimiert,
more » ... lexe optimiert, diese wurden außerdem physiko-chemisch charakterisiert durch Untersuchung der Komplexierung mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und Bestimmung des hydrodynamischen Durchmessers mittels DLS. Es wurde die Effektivität der RNAi nach Transfektion einer konstitutiv Luciferase exprimierenden Zelllinie SKOV-3/Luc bzw. nach eigener Transfektion mit pDNA, die für Luciferase codiert, verglichen und mittels Chemolumineszenz-Assay quantifiziert. Die Spezifität wurde durch Messung unspezifischer Silencing-Effekte mit Kontroll-siRNA abgewandelter Sequenz überprüft, die Komplexe wurden mittels Fluoreszenz-Labelings und Konfokal-Mikroskopie lokalisiert und ihr Zerfall verfolgt.
doi:10.17192/ed.2006.0001 fatcat:yfirctft35b7zia5nvqj3towbu