Avaliação das vias de sinalização de danos e indução de citocinas inflamatórias na presença da toxina BthTX-I, isolada da peçonha de Bothrops jararacussu [thesis]

Cássio Prinholato da Silva
DEDICATÓRIA Dedico esse trabalho aos meus avós Wálter, Vera, Antônio e Alzira, aos meus pais e à minha querida namorada por me amarem e pelo carinho . AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por me dar o dom da vida e pelas pessoas maravilhosas que trouxe em minha vida. À Profa. Suely, por abrir as portas de seu laboratório, pela oportunidade de fazer minha pós-graduação e pela disposição em me ajudar com os problemas que sempre lhe apresentei. A meus avós Wálter (in memorian), Vera,
more » ... orian), Vera, Antônio (in memorian) e Alzira (in memorian), pelo amor dado ao longo de suas vidas. Vocês são pessoas maravilhosas em minha vida, obrigado por tanto carinho e amor. A meus pais Francisco e Marli, pelo amor incondicional, pelo carinho, correções e punições, que moldaram meu caráter, pelo incentivo ao longo de minha vida, pelo apoio, fé e esperanças dadas a mim. Vocês são demais. Ao Prof. Sérgio de Albuquerque e à sua aluna Mariana Rosa, pela paciência e apoio na reta final de meu projeto. À Dra. Thaís Gasporoto, da Faculdade de Odontologia de Bauru (USP-BAURU), pela disponibilidade, atenção e colaboração na realização das dosagens de citocinas. Ao Laboratório de Nutrigenômica, onde desenvolvi parte do meu projeto de pesquisa. Obrigado pessoal, por me ajudarem e cederem gentilmente o laboratório, bem como se mostrarem profissionais integros e dedicados. Obrigado pela ajuda. Não posso esquecer também de agradecer a companhia prazeirosa do pessoal do laboratório, meus amigos, Vinicius, Farah, Marinas, Regis, Jeferson, Tarcila, Carla, Léo, Bruno e Xandão, obrigado galera. À minha família do dia a dia, meus irmãos Franco, (que demonstrou ser um profissional digno e exemplo de pessoa), Sante, Luiz, Norival, Marco, Danilo, Lucas, Renato (vovozinho), Thales, Wallace e minhas irmãzinhas, Carolina, Tatiana, Lanuze, nossa "mamãe" Dona Adélia e também a minha super amigona Tássinha, minha "cria", sua moça "crazy" você é nota dez. Obrigado a todos vocês pelos momentos alegres do nosso laboratório. Aos meus amigos de pós, Mateus, Elisa, Johara, Renata, Roberto, Wyllis, Rodrigo, Carol Marroni, Fernanda, Fernando, Felipe. Um agradecimento às minhas amigonas Fabiana, Leka e Maju, pelos bons e divertidos momentos no Flowjo e ModFit. A toda a galera do AikiUSP, pelo ensinamento passado e filosofia de vida, sempre me ajudando e ter "harmonia", "equilíbrio" e disposição para o dia-a-dia. À Regina Aguena (Rê), Ana e Rose, secretárias que sempre se dispuseram a ajudar a todo o momento em que precisei. Aos meus companheiros de futsal de todas as terças e quintas; o pessoal do Prof. Abel, obrigado pelos momentos de descontração e risadas que sempre tivemos. Agradeço a duas pessoas incríveis, Hélder e Raquel, por sua amizade, companheirismo e exemplo de pessoas. Valeu Hélder pela sua ajuda e disposição. Já a você "Teacher" (Raquel), o que eu vou dizer, devo praticamente tudo a você. Você me ensinou tudo que sei, como fazer, porque fazer, onde achar as respostas, criou seu "fiote", me ensinou a ser responsável e dedicado. Vocês dois são exemplos de dignidade, integridade, honestidade, bondade e etc, etc, etc, e mais etc...(rsrs). Agradeço por fazerem parte de minha vida! Por fim agradeço a um alguém todo especial para mim, alguém que ilumina minha vida todo o dia, que me faz enxergar cor onde antes era cinza, alguém que me enche de alegria, carinho e amor. Agradeço a você minha Gatinha (Tamiris), por entrar na minha vida e trazer essa enorme felicidade que sinto ao seu lado, felicidade essa que divido com você a cada dia. Nosso amor surgiu de uma amizade linda e nos amamos de modo tão lindo, hoje não vejo mais minha vida sem você, obrigado por me amar, apoiar, amparar, resumindo, obrigado por me AMAR! Eu a amo meu A..M..O..R! Agradeço às fundações de apoio à pesquisa, CAPES, CNPq e principalmente à FAPESP pelo apoio financeiro (processo nº 2010/03243-3), viabilizando a realização deste projeto. i RESUMO PRINHOLATO DA SILVA, C. Avaliação das vias de sinalização de danos e indução de citocinas inflamatórias na presença de BthTX-I, isolada da peçonha de Bothrops jararacussu. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. As fosfolipases são bastante estudadas e podem ser encontradas de forma abundante nas peçonhas. Algumas fosfolipases que sofrem modificação no resíduo 49 com a substituição do aminoácido Asp por Lys, o que provoca perda do seu sítio catalítico, são classificadas como miotoxinas. A miotoxina BthTX-I foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu, possui 121 resíduos de aminoácidos, pI 8,2 e massa molecular de 13kDa. O objetivo do presente projeto foi avaliar a ação da BthTX-I, quanto à sua ação citotóxica, indutora de morte celular, interferência na cinética celular e expressão de genes responsáveis pela morte celular em quatro linhagens tumorais, HL-60 (leucemia promielocítica), HepG-2 (hepatocarcinoma humano), PC-12 (feocromacitoma murino) e B16F10 (melanoma murino). Também foi analisada a indução de citocinas inflamatórias IL-8 e TNF-α em linhagens humanas HL-60 e HepG2. A citotoxicidade, avaliada pela metodologia do MTT, apresentou valores citotóxicos em torno de 62, 53, 53 e 63%, respectivamente para HepG2, HL-60, PC12 e B16F10. A toxina mostrou ação moduladora do ciclo celular na fase S em células HepG2; na fase G2/M em células HL-60. Nas linhagens B16F10 e PC-12 a toxina provocou atraso na fase G0/G1 e redução de células na fase S e G2/M. O perfil eletroforético em gel de agarose a 1,5% mostrou fragmentação do conteúdo do DNA, indicando possível apoptose, que foi confirmada pelo ensaio de morte celular por citometria de fluxo. O ensaio revelou que a linhagem B16F10 tem maior índice apoptótico (~40%), seguido da HepG2 (~35%), PC-12 (~25%) e HL-60 (~4%). A indução de citocinas pela metodologia de ELISA apresentou valores elevados de IL-8 para linhagem HL-60 (~400 pg/mL) e HepG2 (~400 pg/mL), sugerindo uma possível quimiotaxia/migração de células de defesa. TNF-α também apresentou alteração em seus níveis representando cerca de 150 pg/mL na linhagem HepG2. A expressão dos genes Bax, Bcl-2 e p53 demonstrou que o gene p53 se altera somente na linhagem HepG2, todavia a expressão dos genes Bax e Bcl-2 mostrou ser diferente para cada linhagem. Em células B16F10 a toxina aumentou os níveis de Bax e diminuiu os níveis de Bcl-2 enquanto que, as células PC-12 exibiram aumento nos níveis de ambos. Em HepG2 houve redução da expressão do gene antiapoptótico Bcl-2 e valor inalterado de Bax, ao passo que a linhagem HL-60 apresentou resultado contrário ao de células HepG2, com aumento na expressão de Bax e valores inalterados de Bcl-2. Assim a toxina mostra diferente ação na expressão dos genes responsáveis pela apoptose em diferentes linhagens celulares, mostrando que a BthTX-I influencia a expressão desses genes, ou promove apenas a alteração de dessses, levando assim à apoptose celular das linhagens tratadas com a miotoxina. Diante dos dados obtidos ficou evidenciado o potencial antitumoral da BThTX-I levando a busca de outros mecanismos de atuação da toxina, abrindo perspectivas de sua aplicação biotecnológica para a produção de novo fármaco antitumoral e tornando-se uma terapia alternativa a essa enfermidade. Palavras-chave: BthTX-I, apoptose, miotoxina, morte celular. ii ABSTRACT PRINHOLATO DA SILVA, C. Evaluation of damage signaling pathways and induction of inflammatory cytokines in the presence of BthTX-I, isolated from Bothrops jararacussu snake venom. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Phospholipases are widely studied and can be found in abundance in several animal venoms. Some phospholipases, classified as myotoxins, present a modification at residue 49, with replacement of the amino acid Asp by Lys, causing loss of their catalytic site. BthTX-I was isolated from the venom of Bothrops jararacussu and is a myotoxin with 121 amino acid residues, pI 8.2 and a molecular mass of 13kDa. The aim of this study was to evaluate BthTX-I regarding its cytotoxic action, induction of cell death, interference with cell kinetics and expression of genes responsible for cell death in four tumor cell lines: HL-60 (promyelocytic leukemia), HepG2 (human hepatocellular carcinoma), PC-12 (murine pheochromocytoma) and B16F10 (murine melanoma). The induction of inflammatory cytokines (IL-8 and TNF-α) in the human cell lines HepG2 and HL-60 was also analyzed. Cytotoxicity, as assessed by the MTT methodology, showed values around 62, 53, 53 and 63% for HepG2, HL-60, PC12 and B16F10, respectively. The toxin showed modulating action of the cell cycle in the S phase in HepG2 cells, in the G2/M phase in HL-60 cells and delay in the G0/G1 phase. The toxin also caused a delay in the G0/G1 phase and reduced the number of cells in the S and G2/M phases in B16F10 and PC-12 cell lines. The electrophoretic profile on 1,5% agarose gel showed fragmentation of DNA content, possibly indicating apoptosis, which was confirmed by flow cytometry cell death assays. This assay revealed that B16F10 cells presented a higher apoptotic rate (~40%), followed by HepG2 (~35%), PC-12 (~25%) and HL-60 (~4%) cells. Induction of cytokines analyzed by ELISA showed high levels of IL-8 in HL-60 (~400 pg/mL) and HepG2 (~400 pg/mL) cells, suggesting a possible chemotaxis and migration of immune cells. The levels of TNF-α also showed changes, representing about 150 pg/mL in HepG2 cells and 14 pg/mL in HL-60 cells. Gene expression of Bax, Bcl-2 and p53 showed that the p53 gene did not change only in HepG2 cells, with the gene expression of Bax and Bcl-2 being different for each cell line. The toxin increased the levels of Bax and decreased the levels of Bcl-2 in B16F10 cells, while PC-12 cells showed increased levels of both genes. Regarding HepG2 cells, a decrease in the expression of the antiapoptotic gene Bcl-2 was observed, with unchanged values for Bax, while opposite results were observed for HL-60 cells, with increased expression of Bax and unchanged values of Bcl-2. Thus, the toxin showed different actions on the expression of genes responsible for apoptosis in different cell lines, showing that BthTX-I influences the expression of both genes, promoting changes in one or another apoptotic gene, thus leading the tumor cell lines treated with this myotoxin to apoptosis. The obtained data evidenced the antitumor potential of BthTX-I, leading to the search for other mechanisms of action of this toxin and opening prospects for its biotechnological applications for the production of new anti-cancer drugs.
doi:10.11606/d.60.2012.tde-10012013-154559 fatcat:tx7vc4mw5fgibocxk7zlklkb3y