Expressão gênica de proteínas de choque térmico como marcador molecular de termotolerância em vacas Nelore [thesis]

Henrique Barbosa Hooper
Expressão gênica de proteínas de choque térmico como marcador molecular de termotolerância em vacas Nelore Pirassununga 2015 1. Bos taurus indicus 2. Gerenciamento de calor 3. HSP 4. Leucócitos 5. Termólise. I. Título. DEDICATÓRIA À Deus, minha família e amigos pelo apoio, incentivo, companheirismo, amizade e instrução, o que tornou muito mais fácil minhas escolhas e decisões. Dedico. AGRADECIMENTOS Agradeço à Deus, força maior inexplicável, que me conduz ao melhor caminho e que me fortalece na
more » ... concretização dos meus ideais. Aos meus pais, Adolfo e Denise, meu irmão, Thiago, minha fortaleza, pelo apoio e incentivo incondicionais em mais essa etapa. Aos meus avós, tios e primos pelo carinho de sempre, mesmo à distância. Ao meu orientador, Prof. Dr. Titto, pela oportunidade de continuar o aperfeiçoamento dentro da área da Bioclimatologia, além da amizade e confiança creditados ao meu trabalho. Aos que plantaram a semente das proteínas de choque térmico em mim, o Prof. Dr. Alfredo Pereira e a Dra. Ana Geraldo (Qui), agradeço pela ideia central do trabalho, confiança em pouco tempo de convivência e auxílio além-mar. À Prof.(a) Dra. Cristiane por deixar sua porta sempre aberta para auxiliar em alguma dúvida, dar sugestões e ensinar. Ao Prof. Dr. Ed Hoffmann, pela assistência e cooperativismo. Ao Prof. Dr. Mario Binelli, pelas instruções e por gentilmente conceder seu laboratório para realização das análises. Ao Prof. Júlio Balieiro, pelo auxílio e sugestões quanto às analises estatísticas. À Prof.(a) Dra. Luciane por me emprestar e me aconselhar na utilização da câmera termográfica. Aos pós-graduandos do Laboratório de Biometeorologia e Etologia, Bettah, Raquel, Denis e Thuanny. Em particular, aos grandes parceiros, Fábio, Lina e Ana, que fizeram este trabalho muito mais leve, pelo comprometimento, competência e todas aventuras vividas. E também à nossa técnica, Dra. Thays, pela ajuda, organização e amizade. À todos os "Labeanos" que auxiliaram na execução do Projeto. À Prefeitura do Campus USP de Pirassununga, por disponibilizar os animais para a realização do projeto. À todos os funcionários do Setor de Bovinos de Corte, Ismael, João Batista, Paulo César, Ricardo e o Valdir, peças chave no manejo com os animais, agradeço pela paciência, cooperativismo e disponibilidade. À amiga Angela Gonella, por não medir esforços em me ajudar no longo processo das análises laboratoriais. Eu lhe agradeço por todo seu profissionalismo, ensinamentos, paciência e dedicação. Aos amigos, Thiago (Arroz), Milton, Júlio, Agustin e Julianne pelo apoio nos manejos reprodutivos durante a estação de monta. Aos colegas de pós-graduação da FZEA e da FMVZ pelos momentos no corredor do prédio e descontrações em nossas reuniões, festas e churrascos. Aos meus amigos pelo apoio e carinho. À Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos por me acolher e dar suporte no ensino e pesquisa durante a Pós-graduação. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela concessão da bolsa durante todo o período de realização deste Mestrado. "A alegria não chega apenas no encontro do achado, mas faz parte do processo da busca. E ensinar e aprender não pode dar-se fora da procura, fora da boniteza e da alegria." Paulo Freire RESUMO HOOPER, H. B. Expressão gênica de proteínas de choque térmico como marcador molecular de termotolerância em vacas Nelore. 2015. 76 f. Dissertação (Mestrado) -Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2015. Objetivou-se com este estudo compreender as dinâmicas das temperaturas corporais em fêmeas da raça Nelore, e relacionar os aspectos fisiológicos da termorregulação com as respostas celulares pela expressão de proteínas de choque térmico. O projeto foi desenvolvido no -SP. Foram utilizadas 20 vacas Nelore pluríparas, cíclicas, mantidas em sistema de pastejo. O período experimental precedeu a estação de monta de 2013 e terminou na inseminação artificial. Para classificar os animais quanto ao gerenciamento de calor foi monitorada a temperatura vaginal durante seis dias por meio de 16 data loggers (n=16). Com o intuito de melhor compreender o gerenciamento de calor, outras respostas fisiológicas, nomeadamente temperatura retal, caudal, ocular, frequência respiratória e taxa de sudação foram colhidas durante os quatro dias finais do monitoramento da temperatura vaginal. Para expressão gênica relativa colheram-se amostras de sangue (n=20). Foram realizados choques térmicos in vitro a 38°C, 40°C e 42°C por duas horas. Após tratamento térmico obteve-se o pellet de leucócitos para posterior extração do RNA pelo método TRIzol. Foram escolhidas 10 vacas com os melhores resultados de concentração de RNA, 5 pertencentes ao grupo de vacas eficientes quanto ao gerenciamento de calor, e 5 não eficientes (n=10). A RT-PCR foi realizada com o kit SuperScript III. A reação polimerase em cadeia em tempo real (qPCR) ocorreu no aparelho StepOnePlus® Applied Biosystem utilizando como marcador fluorescente o SYBR® Green para os genes alvo validados HSPA1A, HSPD1, HSP90AA1, HIF1A e endógenos ACTB, RPL15 e PPIA. Os dados foram analisados por ANOVA, regressão e correlação do SAS 9.2. As vacas foram classificadas em eficientes e não eficientes por meio de coeficientes angulares, advindos da regressão das temperaturas vaginais durante períodos de ganho e perda de calor. As vacas eficientes apresentaram menores temperaturas retais 37,65°C (P<0,01) e maior taxa de sudação 528,73 g. m -². h -¹ (P<0,06). A nível celular, o aumento programado in vitro da temperatura não aumentou quantidade de transcritos, promovendo manutenção à 38°C e 40°C e declínio à 42°C. A ordem decrescente da abundância de transcritos foi HSPA1A, HSPD1 e HSP90AA1. Pode-se concluir que vacas Nelore com diferentes gerenciamentos de calor apresentam respostas termorregulatórias diferentes. A HSPA1A apresentou a maior abundância de transcritos sendo considerada como marcador molecular para termotolerância, por ser a mais sensível à temperatura e bem conservada. Não foi observado diferença nas expressões gênicas relativas das proteínas de choque térmico entre os animais classificados quanto ao gerenciamento de calor. Palavras-chave: Bos taurus indicus; gerenciamento de calor, HSP; leucócitos; termólise. ABSTRACT HOOPER, H. B. Gene expression of heat shock proteins as molecular marker of thermotolerance in Nellore cows. 2015. 76 f. Dissertação The aim of this study was to understand the dynamics of body temperatures in Nellore females, and relate the physiological aspects of thermoregulation with cellular responses by the expression of heat shock proteins. The project was developed in Biometeorology and Ethology Laboratory, Faculty of Animal Science and Food Engineering, University of São Paulo, Pirassununga-SP. Were used 20 Nellore pluriparous cows, cyclical, kept in grazing system. The experimental period preceded the 2013' breeding season and ended up in artificial insemination. To classify animals in relation to heat management the vaginal temperature was monitored for six days through 16 data loggers (n=16). In order to better understand the heat management, other physiological responses, including rectal, tail and eye temperatures, respiratory rate and sweating rate were taken during the final four days of vaginal temperature monitoring. For gene expression was harvested blood samples (n=20). In vitro heat shocks were performed at 38°C, 40°C and 42°C during two hours. After the heat treatment was obtained the leukocyte pellet for later RNA extraction by TRIzol method. Ten cows were chosen with the best RNA concentration results, five belonging to the group of cows efficient on heat management and five inefficient (n = 10). RT-PCR was performed with SuperScript III kit. The real-time polymerase chain reaction (qPCR) occurred in StepOnePlus® Applied Biosystems instrument using the SYBR® Green as fluorescent marker to the target validated genes HSPA1A, HSPD1, HSP90AA1, HIF1A and the endogenous ACTB, RPL15 and PPIA. Data were analyzed using ANOVA, regression and correlation SAS 9.2. The cows were classified as efficient and inefficient through angular coefficients, derived from regression of vaginal temperatures for the gain and heat loss periods. Efficient cows had lower rectal temperature 37.65°C (P<0.01), higher sweating rate 528.73 g. m ². h -¹ (P<0.06). At cellular level, the increase of in vitro programmed temperature has not increased the transcripts amount, promoting the maintenance at 38°C and 40°C and decline at 42°C. The decreasing order of transcripts amount was HSPA1A, HSPD1 and HSP90AA1. It can be concluded that Nellore cows with different heat managements has different thermoregulatory responses. The HSPA1A showed the highest transcripts abundance being considered as a molecular marker for thermotolerance, for being more sensitive to temperature and better conserved. There was no difference in gene expression for heat shock proteins between animals classified by heat management.
doi:10.11606/d.74.2015.tde-08092015-112214 fatcat:vgd2vnuxsjbmhmp5tr6cjxje4e