O óxido nítrico e os nucleotídeos cíclicos em oócitos bovinos maturados in vitro [thesis]

Kátia Regina Lancellotti Schwarz
O óxido nítrico e os nucleotídeos cíclicos em oócitos bovinos maturados in vitro" P Pi ir ra as ss su un nu un ng ga a 2 20 01 11 1 1. Bovinos 2. Maturação 3. oócito 4. óxido nítrico 5. GMPc 6. AMPc. I. Título. AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Profa. Dra. Cláudia Lima Verde Leal, que se portou como só fazem os mestres. Acreditando no meu trabalho, deu-me a liberdade necessária dividindo comigo as expectativas, conduziu-me a maiores reflexões e desta forma enriqueceu-o, certamente você deu
more » ... o a minha vida profissional. Minha especial admiração e gratidão. A amiga Lígia Garcia Mesquita, pela sua contribuição e interesse carinhoso, do início ao final do estudo, estabelecendo comigo uma aliança que se traduziu numa coorientação amigável. Meu respeito, admiração e carinho. A amiga Fabiane Zaffalon, pela deliciosa convivência, pelo carinho, atenção e imensa disponibilidade em me ajudar sempre. Ao amigo Pedro Ratto pelas trocas de informações, esforços e discussões para padronização de todas as técnicas utilizadas neste trabalho. Ao amigo Marcos Roberto Chiaratti, pela humildade e disponibilidade em me ajudar, durante as análises de tempo real, reestabelecendo meu interesse nesse estudo. Ao amigo Tiago De Bem, pela gentileza e carinho de sempre. Ao amigo Luciano Remy, que apareceu em minha vida de uma maneira simples, mas foi fundamental, deixando minha rotina laboratorial menos densa e contribuiu um monte para tornar meu sonho do estágio na UCD -Irlanda realidade. Ao Prof. Dr. Heidge Fukumasu pelas correções na qualificação, sempre solícito e com idéias enriquecedoras. Meus sinceros agradecimentos. Ao Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles, por ter me acolhido durante a Iniciação Científica, dando rumo a minha longa jornada científica. As técnicas de laboratório, Arina L. Rochetti, Gabriela A. Rizzato, Márcia R.M. Silva e Sílvia S Godoy pela eficiência, dedicação e simpatia. Meu muito obrigada. A cada integrante e ex-integrante do Laboratório de Morfo-fisiologia Molecular e Desenvolvimento (LMMD) e Histologia Animal, que tive o prazer e orgulho de trabalhar junto. Muitas pessoas passam pela nossa vida, mas poucas ficam marcadas para sempre por um motivo muito especial, sem vocês nada disso seria possível. Agradeço pelos momentos de convívio, trocas, risos e afeto. Com muitas saudades, obrigada. À FAPESP pela concessão da bolsa de estudos. RESUMO SCHWARZ, K.L. "O óxido nítrico e os nucleotídeos cíclicos em oócitos de bovinos" (106f). 2011. Tese (Doutorado) -Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga 2011. O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluído o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar os níveis de outro nucleotídeo, o AMPc, que é um importante elemento da via de sinalização das gonadotrofinas nos oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente estudo foi de investigar o envolvimento da via do GMPc na ação do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e seu efeito sobre a via do AMPc. Com a maior concentração estudada do doador de NO (10 -7 M de SNAP), apenas 36% dos oócitos conseguiram alcançar o estágio de RVG (P< 0,05), após 9 horas de maturação. Esse atraso também foi observado com diferentes concentrações do estimulador de GC (5, 10 ou 50µM de Proptoporfirina IX) e pelo análogo de GMPc (1, 2 e 4mM de 8-Br-GMPc ), que apresentaram uma taxa média de RVG de 50% para os tratamentos e 70% para os grupos controles sem as drogas (P<0,05). No início da maturação (0h), os níveis de GMPc foram de 5,29 pmol/oócito sofrendo uma queda logo na primeira hora de cultivo para 2,97 pmol nos oócitos do grupo controle e 1,54 pmol nos cultivados com associação de 10 -7 M de SNAP (doador de NO) e 100µM de OQD (inibidor de GC (P<0,05). No grupo de oócitos cultivados apenas com SNAP, os níveis de GMPc se mantiveram em 4,51 pmol/oócito, semelhante ao grupo imaturo (0h de cultivo, P>0,05). O doador de NO manteve estável o nível de GMPc somente na primeira hora de maturação. Após 3 e 6 h de MIV, os níveis de GMPc permaneceram baixos e similares (0,07 a 2,46 pmol/oócito, P>0,05) nos grupos controle (sem drogas), tratado com doador de NO (10 -7 M de SNAP) associado ou não ao inibidor de guanilato ciclase (100µM de OQD). Também foi observada uma queda nos níveis de AMPc em relação ao grupo imaturo (32,42 fmol de AMPc/oócito) para os demais grupos (P<0,05), que apresentaram aproximadamente, 12,0 a 16,0 fmol de AMPc/oócito durante a primeira hora, 3,3 a 8,0 fmol/oócito durante a terceira hora e 7,4 a 18,3 durante a sexta hora de maturação (P>0,05). O NO afetou os níveis de GMPc no início da maturação, mas não os níveis de AMPc. O NO e o GMPc podem atuar no controle da expressão gênica de uma série de proteínas envolvidas no controles dos níveis de AMPc e GMPc ou suas funções. Esse controle pode ser efeito direto do NO (PKG2, PDE3A, PDE4D e PDE8A), do GMPc (ADCY6) ou do NO via GMPc (PKA1) e varia com o compartimento considerado (oócito ou células do cumulus). Esses resultados demonstraram a inter-relação das vias NO/GMPc/AMPc e toda a sua complexidade dependendo do tipo celular e da fase da maturação de oócitos bovinos. Palavras-chave: oócito bovino, maturação in vitro, óxido nítrico, meiose, AMPc, GMPc e SNAP. ABSTRACT The NOS/NO system seems to play an important role in oocyte maturation besides other functions. However, despite the evidence, there are few studies on the possible role of this system in bovine oocytes. It is known that NO acts via guanylate cyclase (GC) by stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn can influence the levels of another nucleotide, cAMP, which is an important element of the signaling pathway of gonadotropins in oocytes and in the control of oocyte maturation. The aim of the present study was to investigate the involvement of the cGMP pathway in the action of the NOS/NO system on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and its effect on the cAMP pathway. The highest studied concentration of the NO donor (10 -7 M SNAP), only 36% of oocytes were able to undergo GVBD (P < 0.05) after 9 hours of maturation. This delay was also observed with different concentrations of the GC stimulator (5, 10 or 50μM Proptoporfirin IX) and the cGMP analogue (1, 2 and 4 mM 8-Br-cGMP), which had an average of 50% GVBD for treatment groups and 70% for control groups without drugs (P<0.05). At the beginning of maturation (0 h) cGMP levels were 5.29 pmol/oocyte and decreased within the first hour of culture to 2.97 pmol and 1.54 pmol in the control group and in oocytes cultured in 10 -7 M SNAP (NO donor) associated with 100μM OQD (GC inhibitor; P<0.05). In the group of oocytes cultured only with SNAP, cGMP levels remained at 4.51 pmol/oocyte similar to the immature group (0 h culture, P> 0.05). The increase of NO maintained cGMP levels stable only during the first hours of maturation. After 3 and 6 h IVM, cGMP levels remained low and similar (0.01 to 2.5 pmol/ ocyte, P>0.05) in control (without drugs), treated with NO donor (SNAP 10 -7 M) with or without the guanylate cyclase inhibitor (100μM OQD). A decrease in cAMP levels was also observed when compared with the immature group (32.42 fmol cAMP/oocyte) for the other groups (P <0.05), which showed 12.0 to 16.0 fmol cAMP/oocyte after the first hour, 3.3 to 8.0 fmol/oocyte after the third hour and 7.4 to 18.3 after the sixth hour of IVM (P>0.05). NO and cGMP may act to control gene expression in a series of proteins involved in control of the levels of cAMP and cGMP or their functions. The control may be a direct effect of NO (PKG2, PDE3, PDE4D and PDE8A), cGMP (ADCY6) or NO via cGMP (PKA1) and varies with the compartment considered (oocyte or cumulus cells). The results showed the interrelationship of the NO/cGMP/cAMP pathway and all its complexity depending on the cell type and the stage of maturation in bovine oocytes.
doi:10.11606/t.74.2011.tde-03072012-091027 fatcat:yxetqjuijjcrvijh2adszopx6e