Agradecimentos A Deus por me guiar na busca dos meus sonhos e me dar força e paciência nos momentos de dificuldades. A Profa. Elfriede Marianne Bacchi os meus sinceros agradecimentos pela acolhida em seu grupo de pesquisa, pela contribuição para o meu crescimento profissional e pessoal, pelo exemplo de competência, ética na pesquisa, pelo dom em ensinar e pela amizade ao longo destes anos. Aos Professores Edna Tomiko Myiake Kato, Paulo Chanel Deodato de Freitas e Dominique Hermine Fischer pelas

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... valiosas conversas as quais contribuíram para minha formação profissional e pela amizade. Ao Doutor Ílio Montanari Junior do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Unicamp por ceder gentilmente o material vegetal utilizado neste trabalho. À Profa. Ingrit Elida Collantes Díaz pela atenção, elucidação de substâncias neste trabalho e amizade. À Profa. Patrícia Gama e suas alunas pelo auxílio e atenção na análise de imuno-histoquímica. Ao Prof. Dr. Guerra pelo auxílio na análise histológica. Ao Prof. Felipe Rebello Lourenço pelo auxílio na análise de endotoxina e pela colaboração nas análises estatísticas. Ao Prof. Jorge Mancini e suas alunas Ana Mara de Oliveira e Silva e Fernanda Carvalho de Santana pela orientação e contribuição na análise de atividade antioxidante. À Profa. Patrícia Santos e seu aluno Fúlvio pela colaboração na análise de citotoxicidade in vitro e pela amizade, contribuindo na execução deste trabalho. À Profa. Elaine Hatanaka e seus alunos pelo auxílio e atenção nas análises de potencial antiinflamatório. À Profa. Ivana Suffredini por disponibilizar o uso do liofilizador. À aluna de iniciação científica Marília Parasin pela contribuição e dedicação para a realização deste trabalho. Ao técnico Roberto de Jesus Honório pela amizade e prontidão para sempre ajudar nos experimentos. Aos amigos e colegas de laboratório Leandro, Alexandra, Angela (in memorian), Alberto, Pedro, Caio, Bruno pela amizade e pela disponibilidade em sempre ajudar. Aos funcionários do Biotério do conjunto das Químicas pela disposição e atenção no ensinamento de como manipular os animais. Aos funcionários do Departamento de Farmácia David e Alexandre pela amizade, pelo esclarecimento de dúvidas e por sempre serem prestativos. À funcionária Leila Aparecida Bonadio da biblioteca do Conjunto das Químicas pela revisão das referências bibliográficas. Aos meus pais Manoel e Helenice e ao meu irmão Guilherme por sempre me apoiar em minhas escolhas e nunca medir esforços para a concretização dos meus sonhos. Amo vocês! Ao meu esposo Cleber que sempre esteve no meu lado nos momentos de alegria e de dificuldades. Pelos seus conselhos, pela sua companhia, pelo seu carinho. Meus dias se tornam mais leves ao seu lado. Te amo! As minhas queridas amigas (Gisele e Meiri) as quais tive a oportunidade de conhecer e conviver durante um período da pós-graduação. Levarei para sempre esta amizade comigo. À amiga Fabi obrigada pelas nossas conversas, conselhos e prontidão para ajudar nos experimentos de análise microbiana. À Capes pelo apoio financeiro. Enfim, a todos os colegas, amigos e familiares que contribuíram diretamente e indiretamente para a concretização deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos! "Não deixe que os seus medos tomem o lugar dos seus sonhos." Walt Disney Resumo GONÇALVES, Flávia Sobreira. Mecanismos de Ação Relacionados à Atividade Antiúlcera de Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. (Crassulaceae). 2017. 134f. Tese (Doutorado) -Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2017. Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. (Crassulaceae) é uma espécie muito empregada na medicina tradicional no Brasil e em outras partes do mundo, especialmente Índia, países da África e China. É indicada popularmente para diversos fins incluindo o tratamento de úlceras gástricas. A análise fitoquímica revelou a presença de vários constituintes, em especial os flavonoides. O tratamento de úlcera gástrica convencional apresenta diversos efeitos colaterais e, na maioria das vezes, não evita a recidiva da lesão. Dessa maneira, é interessante encontrar uma terapêutica mais segura e efetiva. Com o objetivo de avaliar a segurança, foi realizado ensaio de citotoxicidade do extrato bruto, in vitro, com valor de IC 50 igual a 0,926 mg/mL, sendo possível predizer um valor de LD 50 (1341,46 mg/kg) . Já em relação ao ensaio de citotoxicidade, in vitro, da fração acetato de etila não foi encontrado um valor de IC 50 . Resultados de fototoxicidade, in vitro, mostraram que o extrato bruto e fração acetato de etila de K. pinnata não possuem potencial fototóxico. A contagem microbiana na droga vegetal para bactérias aeróbias/mesófilas foi de 6,9 x 10 4 UFC/g e a contagem de bolores e leveduras foi de 2,4 x 10 3 UFC/g, ambos valores dentro do limite estabelecido pela OMS. Análise de endotoxinas também foi realizada para o extrato bruto (<4,0.10 5 UE/kg) e fração acetato de etila (<2,7.10 5 EU/kg) de K. pinnata. Referente à fitoquímica, diversos flavonoides foram identificados no extrato bruto e fração acetato de etila de K. pinnata. Paralelamente ao estudo fitoquímico foi verificado que a atividade gastroprotetora do extrato bruto envolve a ação das prostaglandinas e grupamentos sulfidrila. Já o mecanismo de gastroproteção da fração acetato de etila é dependente de prostaglandinas e óxido nítrico. A atividade cicatrizante do extrato bruto de K. pinnata também foi avaliada. De acordo com os resultados macroscópicos, as doses de 200mg/kg e 400 mg/kg reduziram a área de lesão, com uma taxa de 33% e 39%, respectivamente, após 7 dias de tratamento (p<0,05). Análise histológica dos grupos tratados com o extrato bruto (200 e 400 mg/kg) indicou melhor recuperação da lesão, verificada pela regeneração da mucosa gástrica e pelo restabelecimento da arquitetura glandular. As enzimas antioxidantes (catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) e a expressão de VEGF foram avaliadas no mecanismo de cicatrização de úlceras gástricas. Os resultados mostraram que a atividade antiulcerogênica foi mediada pela ação antioxidante da enzima SOD. Não foi evidenciado in vivo o aumento da expressão de VEGF e nem o sequestro do radical peroxil nos animais tratados com o extrato bruto. Os resultados dos ensaios in vitro (ORAC) mostraram uma maior capacidade de sequestro de radicais peroxil da fração acetato de etila (1192,35 ± 112,61 μmol equivalente de Trolox/g de amostra seca) quando comparado com o extrato bruto (431,32 ± 7,17 μmol equivalente de Trolox/g de amostra seca). A atividade anti Helicobacter pylori também foi avaliada, no entanto, o extrato bruto não apresentou atividade anti H.pylori. Ademais, o extrato bruto demonstrou um potencial anti-inflamatório, pois foi observada uma redução nos níveis de TNF-α e Lselectina, após o tratamento em neutrófilos estimulados com LPS. Analisando os resultados sugere-se que K. pinnata possui um potencial terapêutico no combate de úlceras gástricas e possivelmente, anti-inflamatório, sendo que os flavonoides podem estar relacionados com o efeito biológico observado. Palavras Chave: Kalanchoe pinnata; Crassulaceae; úlcera gástrica; flavonoides; mecanismo de ação. Abstract GONÇALVES, Flávia Sobreira. Mechanisms of action underlying antiulcer activity of Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. (Crassulaceae). 2017. 134f. Tese (Doutorado) -Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2017. Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. (Crassulaceae) is a commonly used species in traditional medicine in Brazil and in other parts of the world, especially India, Africa and China, for the treatment of various diseases, including gastric ulcers. Phytochemical analysis revealed the presence of several constituents in this plant, especially flavonoids. The available pharmaceutical products to treat peptic ulcer have several side effects and, in most cases, do not prevent recurrence of the gastric lesions. Therefore, it is important to find a safer and more effective therapy. In order to evaluate safety, the in vitro cytotoxicity assay of crude extract from K. pinnata was performed. The IC 50 value was 0,926 mg/mL corresponding to LD 50 value (1341, 46 mg/kg). It was not determined IC 50 value in vitro cytotoxicity assay for ethyl acetate fraction from K. pinnata. Neither the crude extract nor ethyl acetate fraction from K. pinnata showed phototoxicity. Microbial counting was performed on the K. pinnatabased drug in order to investigate microbiological contamination. The microbial count for aerobic / mesophilic bacteria was 6.9 x 10 4 CFU/g, and yeast count was 2.4 x 10 3 CFU/g, both values in agreement with the limits established by WHO. Endotoxin analysis was also performed for the crude extract (<4,0.10 5 UE/kg) and for ethyl acetate fraction (<2,7.10 5 UE/kg) from K. pinnata. In the phytochemical analysis several flavonoids were identified in the crude extract and ethyl acetate fraction of K. pinnata. In parallel to the phytochemical study, it was verified that the gastroprotective activity of the crude extract of K. pinnata involved prostaglandins and sulfhydril compounds. On the other hand, the mechanism of gastroprotection of the ethyl acetate fraction of K. pinnata is dependent on prostaglandins and nitric oxide. The healing activity of the crude extract of K. pinnata was also evaluated. According to the macroscopic results the dose of 200 mg/kg and 400mg/kg reduced the injury area, with a rate of 33% and 39%, respectively, after 7 days of treatment (p <0.05). Histological analysis showed regeneration of the gastric mucosa and re-establishment of the glandular architecture in groups treated with the crude extract (200 and 400 mg/kg). Antioxidant enzymes (catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase) and VEGF expression were evaluated in the mechanism of gastric ulcer healing. The results showed that the antiulcerogenic activity was mediated by SOD. It was not demonstrated an increase in VEGF expression and nor in the in vivo sequestration of the peroxyl radical in the animals treated with crude extract. The results of in vitro assay (ORAC) showed a greater sequestering of peroxyl radical to the ethyl acetate fraction (1192,35 ± 112,61 μmol equivalent of Trolox/g of ethyl acetate fraction) when compared to the crude extract (431,32 ± 7,17 μmol equivalent of Trolox/g of crude extract) of K. pinnata .The anti Helicobacter pylori activity was also evaluated; however, the crude extract did not show anti H. pylori activity. However, the crude extract of K. pinnata demonstrated an anti-inflammatory potential, because TNF-α and Lselectin levels were reduced after treatment in LPS-stimulated neutrophils. The analysis of the results suggests that K. pinnata has a therapeutic potential against gastric ulcers and possible anti-inflammatory properties, and the flavonoids may be linked to the biological effect.