Ação sinérgica entre terapia fotodinâmica e terapia hipertérmica utilizando nanobarras de ouro [thesis]

Lucas Freitas de Freitas
A Deus, pela presença, por todo o amparo e proteção durante toda a minha vida. Aos meus pais, Agostinho e Fátima, pelos exemplos e ensinamentos morais que me garantiram uma conduta idôneae pelo sustento material que garantiu meu percurso. Aos meus irmãos, Leandro, Luciana e Lisiane, os quais me apoiaram desde o início e contribuíram significativamente para que realizasse minhas aspirações. À professora Dra. Ana Maria de Guzzi Plepis, cuja orientação foi fundamental para meu crescimento
more » ... rescimento profissional e intelectual. A Vitor Basso Schul que me apresentou a linha de pesquisa, o laboratório e me incentivou desde a graduação. À Dra. Virgínia C. A. Martins, por todo o auxílio imprescindível e não menos abnegado que dispensou a mim, contribuindo de forma fundamental para a conclusão de meu trabalho. Ao Dr. Nelson Junior, por todo o auxílio com a parte histológica e de biotério, além da amizade em todos esses anos. À professora Dra. Janice Rodrigues Perussi, que gentilmente cedeu alguns dos materiais utilizados neste trabalho. Ao professor Dr. Anderson Ribeiro, da Universidade Federal do ABC, que gentilmente sintetizou e cedeu as ftalocianinas utilizadas neste trabalho. À professora Dra. Cristina Kurachi, juntamente com Dr. Clóvis Grecco, Dra. Lilian Tan Moriyama e Dra. Natalia Inada, os quais me auxiliaram em toda a parte in vivo deste trabalho e me acolhem até hoje de forma calorosa em seu laboratório. A todos os integrantes do Grupo Yanagi Taiko, cujos momentos passados juntos me proporcionaram o alívio dos problemas do dia-a-dia e me fizeram sentir bem acolhido na cidade de São Carlos. Um agradecimento especial a Sônia Mitsue Kaibara, e Guilherme Kawamata, Kamila Kotsubo e Érika Takahashipela amizade sincera. A todos os meus colegas república, de doutorado e de laboratório, com os quais me diverti durante todos os momentos juntos, e aprendi lições preciosas para a vida. Ao professor Dr. Michael R. Hamblin que, juntamente com Andrea Brissette, Nicole Devoe e Yingying Huang, me deram a oportunidade de fazer boa parte de meu doutorado em seu laboratório no Wellman Center for Photomedicine, Boston. A William Bruillete, Florian Anzengruber, Fabiano Oliveira Antoniak, Sebastian Fischer e Tania Rogalska, amigos que fiz em Boston e cuja amizade iniciada lá permanece mesmo diante da distância que nos separa. Um agradecimento especial a Mariana Moraes, Paula Llanos e Vanessa R. Machado, pois as considero irmãs, mais do que amigas. Aos professores de todo o período do doutorado, que certamente contribuíram de alguma forma para meu crescimento pessoal. Finalmente, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo -FAPESP, que financiou a realização deste trabalho (Processo 2011-23660-0). "If I have seen further, it is by standing on the shoulders of giants". Isaak Newton, em referência a Bernardo de Chartres RESUMO DE FREITAS, L. F. Ação sinérgica entre terapia fotodinâmica e terapia hipertérmica utilizando nanobarras de ouro. 2016. 116 pp. Tese (Doutorado) -Programa de Pós Graduação Interunidades Bioengenharia, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2016. Estudos com tratamento hipertérmico de tumores utilizando nanopartículas metálicas têm sido realizados durante as últimas décadas e mostram resultados bons quanto à remissão de tumores, por vezes chegando à cura completa. O mesmo acontece em relação aos tratamentos baseados em ação fotodinâmica de fotossensibilizadores. Tratamentos aliando a terapia hipertérmica com nanopartículas de ouro e a terapia fotodinâmica com diversos fotossensibilizadores tem efeito sinérgico e apresenta excelente potencial terapêutico, em que pese serem necessários mais estudos para que uma nova terapia conjunta possa ser implementada. A proposta deste trabalho foi investigar esse efeito sinérgico utilizando nanobastões de ouro complexados com fotossensibilizadores. Após a síntese dos nanobastões pelo método de seeding, a eficácia do tratamento fotodinâmico e da terapia hipertérmica, separadamente, foi investigada. A metodologia do recobrimento dos nanobastões por fotossensibilizador, em um primeiro momento, não logrou êxito com a porfirina, porém com a ftalocianina tetracarboxilada se mostrou mais eficaz. A taxa de fotodegradação da ftalocianina em solução foi investigada como parâmetro para a eficiência em geração de oxigênio singlete. Após centrifugação e lavagem das nanopartículas, no entanto, evidenciou-se por espectrofotometria que o fotossensibilizador não permaneceu aderido aos nanobastões. Em um segundo momento, optamos por recobrir os nanobastões por porfirinas tetrassulfonadas, com ou sem grupamentos metil-glucamina. Após o processo de recobrimento, essas ftalocianinas formaram complexos iônicos com o CTAB que recobre os nanobastões. Os complexos nanobastões-ftalocianinas foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão e as taxas de geração de oxigênio singlete e de radical hidroxil foram investigadas. Além disso, foram utilizadas para testes in vivo e in vitro com células de melanoma melanótico (B16F10) ou amelanótico (B16G4F). As células tumorais em cultura ou os tumores em camundongos C57BL6 foram irradiados com luz em 635 nm e os tumores foram observados por 15 dias após o tratamento. Houve evidente aumento na geração de oxigênio singlete por ambos fotossensibilizadores, e maior geração de radicais livres por parte do fotossensibilizador metilglucaminado. O oposto ocorre com o fotossensibilizador sem metilglucamina. Houve, também, moderada citotoxicidade no escuro quando células foram incubadas com nanopartículas recobertas por ftalocianinas ou não. Quando ativados pela luz, os complexos ftalocianinas-nanobastões desencadearam um aumento de 5ºC no meio de cultura das células, e a morte celular observada foi extensa (91% para a linhagem B16G4F e 95% para a linhagem B16F10). Tanto os resultados in vitro quanto os in vivo indicam que as propriedades das ftalocianinas testadas são melhoradas significativamente quando elas estão complexadas aos nanobastões. Este é um estudo pioneiro por utilizar duas porfirinas tetrassulfonadas específicas e por utilizar o mesmo comprimento de onda para a ativação dos fotossensibilizadores e nanobastões. ABSTRACT DE FREITAS, L. F. Synergic action between photodynamic therapy and hyperthermic therapy using gold nanorods. 2016. 116 pp. Thesis (PhD) -Programa de Pós Graduação Interunidades Bioengenharia, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2016. Studies with hyperthermic tumor ablation using metallic nanoparticles have been performed on the last decades, and show promising results on tumor remission, sometimes achieving the complete cancer elimination. The same occurs regarding on treatments based on photodynamic activity of photosensitizer compounds. Studies indicate that those therapeutic interventions -hyperthermic therapy using gold nanorods and photodynamic activity with many photosensitizers -together can present a synergistic effect, and offer a great therapeutic potential, although more investigation needs to be performed before such approach could be implemented. We proposed to investigate the effect of the attachment of photosensitizers onto the surface of gold nanorods (well-characterized devices for hyperthermia generation). After nanorods synthesis through a seed-mediated method, the PDT and hyperthermia's efficacy was assessed separately. The method used for covering the gold nanorods with photosensitizers did not permit, in a first approach, the attachment of porphyrins onto the nanoparticles surface, but the attachment of tetrasulfonated phthalocyanines was more successful. The phthalocyanine's degradation rate was assessed as an indirect parameter of singlet oxygen generation. After centrifuging and washing the nanoparticles, we saw that the photosensitizers do not keep attached to the nanorods. On a second approach, we chose to recover the nanorods with two zinc phthalocyanines -with or without methyl-glucamine groups. After the recovering process, the phthalocyanines formed ionic complexes with the CTAB that is previously recovering the nanoparticles. The nanorod-phthalocyanines complexes were analyzed by TEM, and their singlet oxygen and hydroxyl radical generation yield were assessed. Furthermore, they were tested in vitro in melanoticB16F10 and amelanotic B16G4F melanoma cells, and in vivo. The tumor cells (in vitro) and the tumor tissue (in vivo) with nanoparticles were irradiated with laser (at 635 nm), and the tumor growth in mice was observed for 15 days after the laser irradiation. It is evident the increase in the singlet oxygen generation, and higher HPF activation for the glucaminated Pc, but the inverse for the other photosensitizer. It seems like there is a type I to type II switch on the action mechanism of the latter Pc. A mild cytoxocity was observed with the nanorods conjugated with photosensitizer in the dark, but when they are activated by light (and taken into account a 5º C rise in the temperature because of the surface plasmon resonance from the gold nanorods), the cell killing is intense (91% for B16G4F cell line, and 95% for B16F10 cell line). Both in vitro and in vivo results indicate that the photodynamic properties of the phthalocyanines tested are enhanced when they are attached onto the nanorods surface. This is a novel study because we used two tetrasulfonated phthalocyanines and because we used the same wavelength to activate both the nanorods and the photosensitizers.
doi:10.11606/t.82.2016.tde-22062016-111916 fatcat:4apclgpxbffabfj3x62wr6cf2i