Efeito de extratos ricos em antocianinas ou elagitaninos de amora silvestre (Morus nigra L.), amora preta (Rubus spp), e grumixama (Eugenia brasiliensis Lam) no crescimento e na expressão de genes e miRNAs de diferentes linhagens de céluas humanas de câncer de mama [thesis]

Gabriela Rezende Costa
Efeito de extratos ricos em antocianinas ou elagitaninos de amora silvestre (Morus nigra L.), amora preta (Rubus spp), e grumixama (Eugenia brasiliensis Lam) no crescimento e na expressão de genes e miRNAs de diferentes linhagens de células humanas de câncer de mama. Efeito de extratos ricos em antocianinas ou elagitaninos deamora silvestre (Morus nigra L.), amora preta (Rubus spp), e grumixama (Eugenia brasiliensis Lam) no crescimento e na expressão de genes e miRNAs de diferentes linhagens de
more » ... células humanas de câncer de mama. Gabriela Rezende Costa Versão corrigida da Dissertação/Tese conforme resolução CoPGr 6018 O original encontrase disponível no Serviço de Pós Graduação da FCF/USP. Tese para obtenção do Título de DOUTOR Orientador: Prof. Dr. Thomas Prates Ong São Paulo RESUMO COSTA,G.R. Efeito de extratos ricos em antocianinas ou elagitaninos de amora silvestre (Morus nigra L.), amora preta (Rubus spp) e grumixama (Eugenia brasiliensis Lam) no crescimento e na expressão de genes e miRNAs de diferentes linhagens de células humanas de câncer de mama. 2017. Tese (Doutorado) -Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, 2017. O câncer de mama caracteriza-se globalmente como a neoplasia de maior incidência e mortalidade na população feminina. Antocianinas e elagitaninos presentes em frutas como as berries destacam-se por seu promissor efeito protetor em diferentes estágios do desenvolvimento do câncer de mama. Grumixama (G; Eugenia brasiliensis Lam) é uma espécie de cereja nativa do Brasil que assim como as amora-preta (AP; Rubus spp) e silvestre (AS; Morus nigra L.) contém alto teor de antocianinas e elagitaninos. Poucos estudos focaram na ação anticâncer destas berries no câncer de mama. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de extratos ricos em antocianinas ou elagitaninos de G, AP e AS no crescimento e na expressão de genes e miRNAs das linhagens de células humanas de câncer de mama MCF-7 (receptor de hormônio positiva) e MDA-MB 231 (receptor de hormônio negativa). Não se observou citotoxicidade após 72 e 96 horas de tratamento com os extratos (25-200µg/mL) ricos em antocianinas (ASANT, APANT e GANT) ou elagitaninos (APELA e GELA), em ambas as linhagens celulares. Após 72 horas de tratamento, GANT e APANT induziram parada de ciclo celular em G0/G1 (12,5 e 50µg/mL, p<0,05) em células MCF-7. Após 96h, ASANT, APANT e GANT induziram parada de ciclo celular em G0/G1 (12,5 e 50µg/mL; p<0,05) nessas mesmas células. Entretanto, na concentração de 200µg/mL apenas GANT induziu parada em G0/G1 (72 e 96h; p<0,05). Em células MDA-MB 231, após 96h APANT e GANT induziram parada de ciclo celular em G0/G1 nas concentrações testadas (12,5, 50 e 200µg/mL, p<0,05), assim como ASANT nas concentrações de 12,5 e 50µg/mL (p<0,05). Em células MCF-7, após 72h APELA e GELA induziram aumento da proporção de células em subG0 (200µg/mL, p<0,05). Em MDA-MB 231, após 72 e 96h, APELA e GELA (200µg/mL) induziram aumento da proporção de células em subG0 (p<0,05) e parada em G0/G1 (p<0,05). Em células MCF-7, GANT induziu morte celular por apoptose (p<0,05) após 72 e 96h de tratamento. Entretanto, em MDA-MB 231 os extratos ricos em antocianinas não induziram morte celular. Em células MCF-7, após 96h GELA e APELA induziram principalmente necrose (p<0,05). Em MDA-MB 231, APELA e GELA induziram apoptose (p<0,05) após 72 e 96h. Em células MDA-MB 231, após 72h de tratamento foi observada inibição da proliferação celular por GELA, GANT e APELA (200µg/mL; p<0,05). Em células MDA-MB 231, 48h de tratamento com GELA; GANT e APELA (200µg/mL) aumentaram a expressão 5 genes (ESR2, FOXA1, JUN, PTGS2,VEGFA) e inibiram a expressão de 10 genes (ADAM23, ATM, BCL2, CDH1, EGF, GLI1, ID1, MKI67, SNAI2 e THBS1) correlacionados ao câncer de mama. Adicionalmente, GELA; GANT e APELA (200µg/mL) induziram aumento da expressão de miR-210(p<0,05) e APELA (200µg/mL) reduziu a expressão de miRNA 19a/b (p<0,05) em células MDA-MB 231. Coletivamente estes resultados sugerem que antocianinas de grumixama e elagitaninos de amora preta e grumixama apresentam potencial efeito protetor contra o câncer de mama. Adicionalmente, essa ação anticarcinogênica pode ser mediada por indução de morte celular, mais especificamente apoptose, redução de proliferação celular e modulação da expressão de genes e miRNAs relacionados ao câncer de mama. Palavras Chaves: berries, antocianinas, elagitaninos, câncer de mama ABSTRACT COSTA, G.R. Effects of extracts rich in anthocyanins or ellagitans from mulberry (Morus nigra L.), blackberry (Rubus spp) and grumixama (Eugenia brasiliensis Lam) on cellular growth and gene and miRNAs expression from distinctive human breast cancer cell lines. 2017. Thesis (PhD) -Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 2017. Breast cancer is characterized as the neoplasia with the highest incidence and mortality rates in women worldwide. Anthocyanins and ellagitannins present in certain fruits, such as berries, stand out for their promising protective effect at different stages of breast cancer development. Grumixama (G; Eugenia brasiliensis Lam), a cherry species from Brazil, as well as blackberry (AP; Rubus spp) and mulberry (AS; Morus nigra L.) contain elevated concentrations of anthocyanins and ellagitannins. Few studies focused on the anticarcinogenic action of these berries in breast cancer development. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effects of extracts rich in anthocyanins or ellagitannins from G, AP and AS on cellular growth and genes and miRNAs expression in human MCF-7 (hormone receptor positive) and MDA-MB 231 (hormone receptor negative) cell lines. No cytotoxicity was observed after 72 and 96 hours of treatment with extracts rich in anthocyanin (25-200 µg/mL) (ASANT, APANT and GANT) or ellagitannins (APELA and GELA) in both cell lines. After 72 hours of treatment, GANT and APANT induced cell cycle arrest at G0/G1 (12.5µg/mL and 50µg/mL, p<0.05) in MCF-7 cells. After 96h, ASANT, APANT and GANT induced cycle arrest at G0/G1 (12.5 and 50µg/mL; p<0.05) in MCF-7 cells. However, at 200µg/mL, only GANT induced G0/G1 (72 and 96h; p<0.05). In MDA-MB 231 cells, after 96h APANT and GANT induced cell cycle arrest at G0/G1 with the three tested concentrations (12.5, 50 and 200µg/mL, p<0.05), as well as ASANT at concentrations 12,5 and 50µg/mL (p <0.05). In MCF-7 cells, after 72h APELA and GELA induced an increase in the proportion of cells in subG0 (200µg/mL, p<0.05). In MDA-MB 231, after 72 and 96h, APELA and GELA (200µg/mL) induced an increase in the proportion of cells in subG0 (p<0.05) and cell cycle arrest in G0/G1 (p<0.05). In MCF-7 cells, GANT induced apoptosis (p<0.05) after 72 and 96h of treatment. However, in MDA-MB 231, extracts rich in anthocyanins did not induce cell death. In MCF-7 cells, after 96h GELA and APELA induced mainly necrosis (p<0.05). In MDA-MB 231, APELA and GELA induced apoptosis (p<0.05) after 72 and 96h. In MDA-MB 231 cells, inhibition of cell proliferation by GELA, GANT and APELA (200µg/mL; p<0.05) was observed after 72h of treatment. In MDA-MB 231 cells, treatment for 48h with GELA, GANT and APELA (200µg) increased expression of 5 genes (ESR2, FOXA1, JUN, PTGS2, VEGFA) and inhibited expression of 10 genes (ADAM23, ATM, BCL2, CDH1, EGF, GLI1, ID1, MKI67, SNAI2 and THBS1) correlated with breast cancer. In addition, GELA; GANT and APELA (200µg/mL) induced increased expression of miR-210 (p<0.05) and APELA (200µg/mL) reduced the expression of miRNA 19a/b (p<0.05) in MDA-MB cells 231. Collectively these results suggest that anthocyanins of grumixama and ellagitannins of blackberry and grumixama have potential protective effect against breast cancer. Additionally, this anticarcinogenic action can be mediated by induction of cell death, more specifically apoptosis, reduction of cell proliferation and modulation of the expression of genes and miRNAs related to breast cancer. AGRADECIMENTOS Primeiro gostaria de agradecer àqueles que estão comigo todos os dias, de corpo ou alma presentes, que torcem por mim, vibram por mim e iluminam minha caminhada. Agradecer o meu companheiro Nobuiuki, que me apoia e me encoraja, que me perturba nos dias dele e me atura nos meus dias. Certamente sem a tua força eu não estaria aqui, não teria nem tentado, e você sabe disso. Obrigada meu amor. Mas para chegar aqui foi preciso muito mais, o meu SER é resultado do que me construiu ao longo da vida, e a minha base é feita de família. Agradeço à minha mãe MARIA, que me ensinou o que era empoderamento muito antes de se falar sobre isso. À minha irmã Fernanda, que como ela mesmo me diz "minhas chatices foram apenas para te preparar para o dia de hoje". Ao meu pai Edmo, meu padrasto Roberto, meus irmãos Gustavo e Arthur, minha cunhada Juciele e meus sobrinhos Julia e Daniel por me fazerem sentir parte de algo maior e de muita força. Agradeço à minha "Grande Família". Meus avós que já se foram, mas me amaram e foram amados sobre todas as coisas. Aos meus tios e tias, primos e primas, vocês sabem que sem vocês nada disso faria sentido. Agradeço aos meus professores, vocês foram o motivo de escolher essa carreira, de querer gerar conhecimento mas principalmente compartilha-lo. Agradeço em especial o meu orientador, Prof. Dr. Thomas Prates Ong, pela oportunidade, pela sutileza nas broncas ao abrir meus olhos de Poliana, e por enxergar meu potencial muitas vezes até mais que eu. À Profa. Dra. Neuza Mariko Hassimotto por participar intensamente desse projeto, por sua disponibilidade em ensinar e oportunidade desta parceria admirável. À Profa. Dra. Silvya Stuchi Maria-Engler por sua total disponibilidade em colaborar, dividindo seu conhecimento e espaço. Agradeço ainda a todos do seu laboratório pela atenção e carinho com que me acolheram. À Renata Albuquerque pela contribuição técnica, pelo sorriso no rosto e por tornar as tardes e até dias inteiros à frente do citômetro mais leves. Agradeço os meus amigos e amigas, que deixei em terras distantes e que encontrei aqui em SP, vocês me conhecem e sabem que são a parte marte mais complexa e maravilhosa de mim. E se por um acaso não estão citados aqui por nome é porque contrapondo meu coração enorme minha memória é digna da Dory (risos). Agradeço Tatiana Pedrosa que me ensinou nos mínimos detalhes como trabalhar com cultura de células, mas da qual, o maior presente foi fortalecer a minha crença de que um bom profissional compartilha seu conhecimento. Obrigada por saber se doar sem ver nisso uma subtração mas sim uma soma. À Van pelo exemplo de profissional, pela amizade e companheirismo mas, principalmente, por me fazer me sentir NORMAL (risos) rs. À Lu pela parceria, que já gerou e espero gere ainda mais frutos, e por tentar me ensinar a ser mais eu. Às minhas parceiras de laboratório Gabriela Novaes, Lívia Ribeiro, Luiza Guido, Natália Castro e Raquel Santana pelo apoio em diversos momentos. Sobretudo Camile Fontelles e Mariana Rosim pelo suporte cômico e etílico. Aos companheiros de trabalho, alunos, técnicos e professores, por compartilharem seus laboratórios e pensamentos, tornando ainda mais prazeroso o aprendizado. Agradeço ao pessoal das secretarias pelo sorriso diário e a prontidão em nos ajudar. À Lurdinha porque tudo foi mais fácil com seu café e sua companhia às 7 da manhã. À Rose pelos inúmeros bons dias e pelo cheirinho de limpeza que eu tanto amo Ao seguranças queridos que zelam por nós em noites e feriados de USP deserta. Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida. Ao Food Research Center (FoRC) pelo apoio financeiro Por ultimo mas não menos importante, agradeço à todos os de fora da FBA pela resiliência, afinal, ser amigo de doutorando não é moleza. Ps.: Agradeço ao Bob, que não sabe ler, mas com sabe me fazer sentir a pessoa mais amada do mundo. Você é o melhor filho canino que alguém poderia querer.
doi:10.11606/t.9.2017.tde-26102017-113658 fatcat:cbgvgym4pngwpcpatxsnp2lmze