Bioorthogonal labeling of neuronal proteins using super-resolution fluorescence microscopy [thesis]

Alexander Kuhlemann
2021
The synaptic cleft is of central importance for synaptic transmission, neuronal plasticity and memory and thus well studied in neurobiology. To target proteins of interest with high specificity and strong signal to noise conventional immunohistochemistry relies on the use of fluorescently labeled antibodies. However, investigations on synaptic receptors remain challenging due to the defined size of the synaptic cleft of ~20 nm between opposing pre-and postsynaptic membranes. At this limited
more » ... e, antibodies bear unwanted side effects such as crosslinking, accessibility issues and a considerable linkage error between fluorophore and target of ~10 nm. With recent single molecule localization microscopy (SMLM) methods von clickbaren GABA-A Rezeptoren in Postsynapsen von dissoziierten hippocampalen Neuronen. Außerdem zeigten Saturierungs-Experimente und FRET-Bildgebung die erfolgreiche Bindung von mehreren Tetrazin-gekoppelten Fluorophoren an uAA-modifizierten, dimerischen GABA-AR α2-Untereinheiten in geringem Abstand (~5 nm). Auf der Basis dieser Resultate werden zukünftig hochauflösende mikroskopische Verfahren, wie dSTORM und click-ExM, in Kombination mit Tetrazin-Farbstoffen die Visualisierung von multimerischen Rezeptoren ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Organisation von synaptischen Proteinen mit minimalem Markierungsabstand im Nanobereich untersucht werden und dadurch neue Einsichten in Rezeptor-Zusammenbau, -Bewegungen und -Wiederverwertung, aber auch Protein-Protein Interaktionen in Synapsen gewonnen werden. Die Weiterentwicklung bioorthogonaler Markierungsstrategien kann in Zukunft dazu beitragen Krankheiten, wie die Limbische Enzephalitis, welche mit GABA-AR Autoantikörpern in Verbindung steht, besser zu verstehen und findet zudem bereits heute Anwendung in Krebstherapien. extracellular anchoring compartments lead to reversible immobilization and trapping of receptors at synapses 12 . Moreover, scaffolding elements and neurotransmitter receptors are not randomly diffusing in the synapses, but are rather organized in stable nanodomains including options to concentrate or disperse receptors by lateral diffusion [13] [14] [15] . The synapse is a highly dynamic space, which requires precise coordination between presynaptic release machinery, postsynaptic scaffolds, receptors, cytoskeletal compartments and transsynaptic adhesion proteins to pursue synaptic formation and ultimately function 12 . Since variations in the diffusional behavior of synaptic receptors could be linked to pathological conditions [16] [17] [18] , the modulation of receptor diffusion and hence, synaptic transmission and plasticity via pharmaceutical reagents offers a major opportunity for novel treatment approaches 19,20 .
doi:10.25972/opus-24373 fatcat:aozopsrguze7lb7gcannzucmoi